吴林 唐农 麻小梅 陈炜 郑福奎 赵海涛 白硕宇 曾冬娟 杨惠丹 邓燕

(1广西中医药大学，广西 南宁 530001；2广西中医药大学附属国际壮医医院；3广西中医药大学第一附属医院)

在导致痴呆的众多病因中，血管性痴呆(VD)是仅次于阿尔茨海默病(AD)的第二大病因，为老年人的多发病，VD给社会和家庭带来沉重的经济负担，已引起国内外的极大关注，至今仍没有确实有效的药物治疗VD，因此，积极探寻防治VD的有效途径，具有重要的社会价值和现实意义。研究已表明VD的学习记忆功能障碍与海马CA1区神经元的凋亡有关，Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的改变最终可导致海马区神经元凋亡〔1〕。本实验通过制作VD模型大鼠，对VD大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响进行研究，探讨温肺降浊方改善VD的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 3月龄健康雄性SPF级SD大鼠120只，体重(200±50)g，由广西医科大学动物实验中心提供(许可证号：SCXK桂2009-0002)。

1.2主要设备及试剂 日本奥林巴斯公司生产的CX-31型电子显微镜，由成都泰盟科技有限公司生产的WMT-100型Morris水迷宫设备全套，美国Media Cybernetics公司生产的多功能图像分析管理系统，德国莱卡生产的RM2015型全自动石蜡切片机，美国Thermo公司生产的CA91786型 UVP凝胶成像系统，DAB(北京中杉金桥公司生产，批号：ZLI-9032)，胃蛋白酶 Pepsin(美国Sigma公司生产，批号：BS0096)，TUNEL试剂盒(美国ROCHE生物科技公司生产，批号：11684817910)，Bcl-2抗体(美国Millpore公司生产，批号：AB1722)，Bax抗体(美国Millpore公司生产，批号：04-434)。

1.3实验药品 温肺降浊方，由制附子20 g，党参15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黄10 g，田七10 g共6味中药组成，(由江苏江阴天江药业有限公司提供，批号：1406033)。石杉碱甲片(浙江震元制药有限公司生产，批号：H20033718)。头孢羟氨苄甲氧苄啶胶囊(哈药集团三精制药诺捷有限责任公司生产，批号：H20056737)，用于造模术后预防感染。

1.4实验方法

1.4.1VD模型大鼠制备 随机从合格的大鼠抽出16只作为假手术组，其余104只大鼠进行VD模型大鼠的制备。参照Ni等〔2〕的双侧颈总动脉永久结扎(2-VO)法将大鼠双侧颈总动脉用4～0无菌蚕丝线永久性结扎制作VD动物模型。假手术组腹腔注射麻醉后行分离双侧颈总动脉手术操作，但不结扎，其余操作及术后处理与模型组相同。

1.4.2Morris水迷宫定位航行实验 各组大鼠按第1、第2、第3、第4象限的顺序，将大鼠面向池壁(大鼠头部向上，以防溺水)依次放入水中，设计大鼠进驻平台的时间(逃避潜伏期时间)为60 s，记录其60 s内成功进驻平台(大鼠找到平台并滞留其上5 s为成功)所需时间(即逃避潜伏期)。如果大鼠在60 s内找不到平台，让它在平台上停留10 s再取出来，且记录大鼠逃避潜伏期时间为60 s。每只大鼠每天训练4次(上、下午各2次)，连续5 d。取4个象限逃避潜伏期时间的均数作计算。

1.4.3造模成功的判定标准 参照赵宪林等〔3〕的VD模型大鼠筛选标准进行判定，即以假手术组大鼠逃避潜伏期时间的均值为参考值，计算模型组大鼠各鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值>20%定为合格的VD大鼠。

1.4.4实验分组 根据随机数字表，本次实验将合格的75只VD模型大鼠随机分到模型组15只，温肺降浊方低剂量组15只，温肺降浊方中剂量组15只，温肺降浊方高剂量组15只，石杉碱甲组15只。

1.4.5灌胃给药 于造模后第15天开始灌胃给药，大鼠灌胃药物剂量的换算方法，均按人与大鼠体表面积系数比确定。给药剂量以临床人用药等效剂量作为中剂量，温肺降浊方低、中、高剂量组大鼠的给药剂量分别为3.75、7.50、15.00 g/(kg·d)，石杉碱甲组给药剂量为0.15 mg/(kg·d)，灌胃浓度每天按1 ml/100 g大鼠体重进行。其中假手术组及模型组均予相应体积的双蒸水灌胃。所有大鼠灌胃给药均为1次/d，共30 d。

1.4.6TUNEL染色 每组随机取7只大鼠进行心脏灌注取脑，先后用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注后，取全脑组织，分别装入有4%多聚甲醛的标本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①经固定后的脑组织，常规石蜡包埋，冠状面连续切片，厚度约4 μm。②切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。③用胃蛋白酶Pepsin孵育。④滴加50 μl的TUNEL反应混合溶液标记并进行孵育。⑤加入50～100 μl二氨基联苯胺(DAB)底物溶液显色。⑥再用苏木素复染细胞核。⑦1%盐酸酒精分化。⑧1%氨水反蓝。⑨常规脱水，透明，封片。⑩在光学显微镜下，观察大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况，细胞凋亡表现为胞体呈三角形或不规则形，形态缩小，核固缩深染，细胞核中有蓝褐色颗粒者为阳性凋亡细胞，而阴性神经元的胞核则不显示成蓝褐色。在每张切片同一区域中随机选取5个互不重叠的视野进行观察阳性细胞数和总细胞数，计算凋亡细胞指数(AI)，AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4.7Western印迹实验 将大鼠进行断头低温新鲜取脑，在冰台上快速分离出双侧海马，立即置于2 ml EP管中，然后放入-80℃液氮中保存，各组大鼠取材完毕后转至-80℃冰箱保存标本，为组织蛋白的提取做准备。①制备十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。②样品的变性及电泳。③凝胶转膜及其检测，恒流250 mA转膜，在含有5%的脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h。将封闭后的膜直接放入稀释后的一抗工作液(Bcl-2、Bax及抗β-actin的抗体)中，4℃反应过夜。用1×PBST洗膜3次。将二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀释3 000倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次。④曝光及洗片。经显影定影液显色，根据条带的亮度及背景情况可以再次选择曝光时间进行二次曝光。用凝胶图像处理系统分析目标带的灰度值。用所测蛋白(Bcl-2、Bax)的灰度值分别与内参照β-actin的灰度值比较，所得的比值表示所测蛋白的相对表达量。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0统计分析软件，进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般情况观察 经过30 d药物灌胃治疗后，观察到温肺降浊方中、高剂量组和石杉碱甲组大鼠恢复至术前正常饮食，精神活动可，反应比较敏捷，毛发也较前润泽，其中温肺降浊方高剂量组大鼠反应较温肺降浊方中剂量组、石杉碱甲组迅速，一有动静即睁眼，跑到栅栏张望；而温肺降浊方低剂量组大鼠只是稍许睁眼；模型组大鼠绝大多数在原地不动，反应迟钝，目光呆滞，存在少食少饮，体重减轻，毛发枯黄无泽的表现；假手术组大鼠行为活动，进食及精神状况等均正常，且性格好动，时常打斗。

2.2TUNEL结果 模型组海马CA1区可见大量分布的阳性细胞，极少见有正常的神经细胞，其AI〔(64.75±2.02)%〕明显高于假手术组〔(7.72±1.69)%〕、温肺降浊方低、中、高剂量组〔(35.30±3.09)%、(23.61±3.02)%、(11.24±3.48%)〕和石杉碱甲组〔(17.03±2.61)%,均P<0.01〕；组间比较发现：温肺降浊方三剂量组组间AI比较差异有统计学意义(P<0.01)；温肺降浊方高剂量组与石杉碱甲组比较差异有统计学意义(P<0.01)；石杉碱甲组与温肺降浊方中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)；温肺降浊方高剂量组与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各药物组中，以温肺降浊方高剂量组抗VD大鼠海马CA1区神经元凋亡的作用最为明显，其次是石杉碱甲组，见图1。

图1 大鼠海马CA1区病理改变(TUNEL染色，×400)

2.3各组海马组织Bcl-2蛋白表达 模型组较假手术组Bcl-2蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。石杉碱甲组、温肺降浊方低、中、高剂量组与模型组比较，Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.01)。组间比较发现：温肺降浊方低、中、高剂量组三者组间Bcl-2蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.01)；温肺降浊方高剂量组与石杉碱甲组比较差异有统计学意义(P<0.01)；石杉碱甲组与温肺降浊方中剂量组比较差异有统计学意义；温肺降浊方高剂量组与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各药物组中，以温肺降浊方高剂量组增加Bcl-2蛋白表达的作用最为显著。见表1，图2。

2.4各组海马组织Bax蛋白表达 模型组较假手术组Bax蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。石杉碱甲组、温肺降浊方低、中、高剂量组与模型组比较Bax蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。组间比较发现：温肺降浊方低、中、高剂量组三者组间Bax蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.01)；温肺降浊方高剂量组与假手术组、石杉碱甲组比较差异有统计学意义(P<0.01)；石杉碱甲组与温肺降浊方中剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)。各药物组中，以温肺降浊方高剂量组抑制Bax蛋白表达的作用最为显著。见表1，图2。

表1 各组海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达比较

与假手术组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01;与石杉碱甲组比较：3)P<0.01;与温肺降浊方高剂量组比较：4)P<0.01;与温肺降浊方低剂量组比较：5)P<0.01

1：假手术组；2：模型组；3：温肺降浊方低剂量组；4：温肺降浊方中剂量组；5：温肺降浊方高剂量组；6：石杉碱甲组图2 各组海马组织Bcl-2、 Bax蛋白表达

3 讨 论

海马是大脑高级神经系统的重要结构组成之一，在学习和记忆功能中起着十分的重要作用〔4〕。研究表明，海马各段解剖组织对缺血的易损伤性分别依次为CA1>CA2>CA3>齿状回〔5〕。海马CA1区锥体细胞发生的迟发性坏死(细胞凋亡)可能是缺血性相关脑血管疾病导致痴呆的主要原因〔6〕。海马以CA1区与学习记忆及空间辨别的关系是最为密切的，故本研究选取海马CA1区进行病理研究，结果表明模型组海马CA1区神经元胞体缩小，核固缩深染，细胞结构层次紊乱，神经元大量凋亡、丢失，而温肺降浊方低、中、高剂量组海马CA1区神经元异常改变较模型组明显减轻，可见VD的学习记忆障碍与海马CA1区神经元凋亡有十分密切的关系。

细胞凋亡的病理机制十分复杂，凋亡过程的详细机制目前尚不完全清楚，凋亡的发生既是凋亡相关基因表达的结果，又受许多内外因素的调节。在缺血缺氧的情况下，既可引起神经细胞的坏死，也可造成神经细胞的大量凋亡〔7〕。凋亡在缺血性神经细胞脱失中起重要的作用〔8〕，实验研究〔9〕发现慢性缺血痴呆大鼠的海马中有明显的细胞凋亡发生，从而会导致严重的学习与记忆障碍。因坏死是具有不可逆转性，而凋亡则具有可塑性，另外细胞凋亡的发生需要一定的时间，这就为VD的治疗创造了很好的机会，并有助于发现药物干预的新分子靶目标。细胞凋亡的最初标志是形态学上的变化，TUNEL法能准确地反映出细胞凋亡最典型的生物化学和形态学特点，对细胞凋亡的检测有很强的特异性。在TUNEL实验结果中，模型组大鼠出现大量成簇的神经元凋亡，神经元凋亡数目较各组明显增多，而温肺降浊方低、中、高剂量组对海马CA1区神经元凋亡数目与模型组比较，均有不同程度减少，而且存在一定量效关系，以温肺降浊方高剂量组的作用最为显著，说明温肺降浊方具有抑制细胞凋亡发生，保护神经元的作用。

Bax和Bcl-2均是Bcl-2家族的重要分子，Bax的作用与Bcl-2相反、相互拮抗，Bcl-2和Bax的表达强度决定着细胞的最终命运。当Bax过量表达则细胞凋亡，Bcl-2过量表达则细胞存活。Bax蛋白表达增加，细胞色素C自线粒体释放，导致凋亡发生的一系列复杂的“瀑布”式反应，且提示细胞凋亡倾向增加，Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，Bcl-2的作用占优势时，细胞色素C不释放入胞质，线粒体凋亡路径不起作用。Bcl-2水平升高提示细胞凋亡概率下降，反之细胞凋亡倾向则会增加〔10〕。研究认为，从分子水平层面促进Bcl-2蛋白的表达、抑制Bax蛋白的表达，可能是抑制神经细胞的调亡、避免脑缺血后VD发生的有效途径之一〔11〕。

根据本实验结果推断，温肺降浊方可通过调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白的表达，从而增强Bcl-2抗凋亡作用，减轻Bax的促凋亡作用，进而抑制VD大鼠海马神经元的凋亡，改善VD大鼠的学习记忆能力。