陈文哲，刘雪莹，郭胜男，孙 涵，窦德强，蔡德成

（1.辽宁中医药大学，辽宁大连116600； 2.大连五舟神草健康科技有限公司，辽宁大连116600）

孔雀草，俗称臭菊花、缎子花，又称法国万寿菊，为菊科万寿菊属植物孔雀草（Tagetes patulaL.），以全草入药。味苦，性凉。具清热利湿、润肺止咳之效［1］。孔雀草是我国民族药，彝族药名依尼补此乌，以花或根入药，主治蛇咬伤、热咳喘及头晕头昏等症，此外还可以治疗上呼吸道感染、痢疾、百日咳、牙痛、风火眼痛，外用治疗腮腺炎、乳腺炎等疾病［2］。在阿根廷孔雀草提取物内服可作利尿剂使用［3］。此外还有研究发现其精油具有抗真菌活性，能够有效治疗植物的念珠菌病和真菌感染［4-6］。目前对于孔雀草的研究多集中于园林植物用于杀菌驱虫，为进一步利用孔雀草的药用价值，本实验通过研究孔雀草水煎液及其组分的抗炎作用以确定其活性组分，并利用HPLC法分析孔雀草水煎液及其组分中主要成分，为孔雀草药用价值的合理开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 KM小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雄性，6～8 w龄，由辽宁长生生物技术有限公司提供（许可证号：SCXK（辽）2015-0001）。

1.1.2 仪器 RE-85Z型旋转蒸发器（巩义市予华仪器责任有限公司）；SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）；HH-S型电热恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；TDZ4-WS低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ-250DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；可调式移液器（美国RAININ（瑞宁）公司）；UV-2100紫外分光光度计（上海UNICO公司）；FA-1004电子天平（上海精科天平厂）；1 mL精密注射器（上海正邦医疗科技有限公司）；打孔器（8 mm）；小鼠固定器（自制）；FD-EA-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）（美国安捷伦科技有限公司）；Acculab型万分之一分析天平（德国 Sartorius group）。

1.1.3 实验试剂 二甲苯（天津市百世化工有限公司，批号：20070416）；伊文思蓝（大连美仑生物技术有限公司，批号：M0507A）；阿司匹林肠溶片（辰欣药业股份有限公司，批号：160419503）；TNF-α ELISA试剂盒（沈阳天和海生物试剂，批号：201608）；IL-6 ELISA试剂盒（沈阳天和海生物试剂，批号：201608）；孔雀草对照品（万寿菊素、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-木糖苷、万寿菊素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷）均为本实验室分离自制；丙酮、乙醚与无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）均为分析纯。甲醇（天津市大茂化学试剂厂）和乙腈（Oceanpak Alexative Chemical），均为色谱纯。

1.1.4 供试药物及其制备 孔雀草，由五舟现代农业发展（大连）有限公司提供，并由辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为菊科万寿菊属植物孔雀草的茎叶。将药材用铁研船粉碎，得粗粉。

称取150 g孔雀草粗粉，第1次加10倍量水，浸润4 h，文火煎煮提取1 h，静置冷却后，水煎液用200目滤布过滤，滤渣加8倍量水，文火再次煎煮1 h，水煎液静置放凉后，滤布过滤，合并两次水煎液滤液，3 000 r/min离心10 min，除去沉淀，上清液减压浓缩回收溶剂，剩余少量溶剂，置低温冷冻干燥机冻干，计算收率（结果见表1）。临用前按照收率取适量0.5%CMC-Na配制成100 g/L（以生药计）溶液。置冰箱中-20℃冻存备用。

称取1 kg孔雀草粗粉，第1次加10倍量水，浸渍4 h，文火煎煮提取1 h，同时提取挥发油；静置冷却后，水煎液用200目滤布过滤，滤渣加8倍量水，文火再次煎煮1 h，同时提取挥发油，水煎液静置放凉后，滤布过滤，合并两次水煎液滤液，将合并后的水煎液沉降离心浓缩至1.5 L。调节乙醇浓度至70%，醇沉2次，将醇沉组分与上清液组分各自合并，65℃严格控温，减压回收溶剂，剩余少量溶剂，置低温冷冻干燥机冻干，计算收率（结果见表1）。临用前按照收率取适量0.5%CMC-Na配制成100 g/L（以生药计）溶液。置冰箱中-20℃冻存备用。

表1 孔雀草各组分收率表

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠耳肿胀实验

1.2.1.1 分组与给药 将70只小鼠按体重随机分为空白组（CO）、模型组（MO）、阳性对照组（PO，阿司匹林0.20 g/kg）、孔雀草水煎液组（WD，2.50 g/kg）、孔雀草醇沉组分组（AP，0.35 g/kg），孔雀草上清液组分组（SU，0.29 g/kg）、孔雀草挥发油组分组（VO，0.75 mg/kg）7组，每组10只。各给药组均给与相应药物，空白组与模型组给予同体积0.5%CMC-Na，给药体积 0.5 mL/20 g，连续灌胃 7 d，各组灌胃时间为09：00。

1.2.1.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验 各组动物末次给药30 min后尾静脉注射0.5%伊文思蓝0.2 mL/20 g。立即在小鼠右耳前后涂抹二甲苯共20 μL，30 min后将小鼠处死，沿耳廓剪下左、右两耳片，用8 mm打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用电子天平精密称定两耳片重量，计算肿胀度，并比较各组间肿胀度及肿胀抑制率的差异［8］。肿胀度为致炎右耳重量与未致炎左耳重量之差。

其中A为肿胀抑制率，B为模型组平均肿胀度，C为给药组平均肿胀度。

二甲苯致炎30 min后摘眼球取血至失血死亡，3 000 r/min离心 10 min，取上清，EILSA法检测血清 IL-6 与 TNF-α 含量［9-11］。

1.2.2 小鼠毛细血管通透性实验 待1.2.1.2实验结束后，将左、右耳片剪碎，放入4 mL 35%丙酮水溶液中，37℃浸泡48 h后，3 000 r/min离心15 min，上清液于UV-2100紫外分光光度计611 nm下测定吸光度，并比较各实验组与对照组吸光度值［7］。

1.2.3 孔雀草化学成分HPLC分析

1.2.3.1 样品制备 对照品溶液的制备：分别取适量万寿菊素、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-木糖苷、万寿菊素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷溶于纯甲醇中，超声至全溶，0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得，置于4℃冰箱保存备用。

孔雀草样品溶液的制备：①孔雀草水煎液样品溶液：取24.23 mg孔雀草水煎液冻干粉于10 mL容量瓶中，60%甲醇定容至刻度，摇匀，制备成浓度为0.1 g/mL（以生药计）的供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得，置于4℃冰箱保存备用。②孔雀草上清液组分样品溶液：取11.53 mg孔雀草上清组分冻干粉于10 mL容量瓶中，60%甲醇定容至刻度，摇匀，制备成浓度为0.1 g/mL（以生药计）的供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得，置于4℃冰箱保存备用。③孔雀草挥发油组分样品溶液：取3 μL孔雀草挥发油组分于10 mL容量瓶中，纯甲醇定容至刻度，摇匀，制备成浓度为0.1 g/mL（以生药计）的供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液即得，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6×150 mm，5 μm）；检测器为二极管阵列检测器（DAD）；以乙腈（C）-磷酸水（D）为流动相梯度洗脱，0～18 min（16%C），18～30 min（16%C-52%C），30～35 min（52%C），35～50 min（52%C ～80%C），50～60 min（80%C）；流速 1.0 mL/min；柱温 28 ℃；进样量：20 μL；检测波长：254 nm。

1.3 统计学方法

数据首先采用Q检验，剔除潜在的离群值，然后采用SPSS17.0统计软件，采用单因素方差分析进行比较。

2 结果

2.1 小鼠耳肿胀实验结果

2.1.1 二甲苯致小鼠耳肿胀肿胀度比较 小鼠右耳涂抹二甲苯后，与空白组比较，模型组的肿胀度明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，孔雀草上清液组、阿司匹林组、孔雀草水煎液组及孔雀草挥发油组分能显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀模型肿胀度（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表 2。

表2 各组小鼠耳肿胀肿胀度比较 （±s）

表2 各组小鼠耳肿胀肿胀度比较 （±s）

注：与 CO 组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与 MO 组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01

?

2.1.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀毛细血管通透性的影响 与空白组比较，模型组小鼠耳廓伊文思蓝染料渗出的吸光度值显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，阿司匹林组、孔雀草水煎液组及各组分均能显著降低小鼠耳廓伊文思蓝染料渗出的吸光度值（P＜0.01）。结果见表 3。

表3 不同组间小鼠耳肿胀毛细血管通透性比较 （±s）

表3 不同组间小鼠耳肿胀毛细血管通透性比较 （±s）

注：与 CO 组比较，1）P＜0.01；与 MO 模型组比较，2）P＜0.01

?

2.1.3 对血清中IL-6与TNF-α含量影响 与空白组相比，模型组小鼠血清IL-6与TNF-α含量均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，阿司匹林组、孔雀草水煎液组、孔雀草挥发油组及上清液组对二甲苯所致的急性小鼠耳肿胀血清炎症因子均有不同程度的抑制作用（P＜0.01）。结果见图1、图2。

2.2 HPLC分析结果

按供试品洗脱条件进样，得到孔雀草各对照品的保留时间（tR，结果见表4），与孔雀草样品色谱图比对识别其对照品色谱峰所代表的化学成分信息。与标准品保留时间比对，孔雀草水煎液与上清液组分的HPLC-DAD图谱均可确定8个峰（结果见图3），分别为：1万寿菊素；2槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷；3槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷；4山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷；5山奈酚-3-O-β-D-木糖苷；6 山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷；7山奈酚；8山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷。而孔雀草挥发油HPLC-DAD图谱中并无对照品存在。

图1 各组小鼠血清中IL-6含量比较

图2各组小鼠血清中TNF-α含量比较

表4 对照品保留时间

3 讨论

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，任何能够引起组织损伤的因素都可成为炎症的原因。炎症的基本病理变化通常概括为局部组织的变质、渗出和增生［12-13］。由二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型为急性炎症模型，急性炎症是机体对致炎因子的刺激所发生的立即和早期反应。炎性渗出是急性炎症的重要特征，炎症过程中参与介导炎症反应的化学因子即炎症介质，有外源性和内源性两大类。TNF-α、IL-6等细胞因子为内源性炎症介质。TNF-α是来源于单核巨噬细胞的细胞因子，能诱导黏附分子在上皮细胞及淋巴细胞的表达，诱导趋化因子的产生，介导炎症细胞向炎症局部聚集［2］。IL-6作为促炎细胞因子由活化的肥大细胞和巨噬细胞产生，具有放大炎症反应、促进急性时相反应物质产生趋化因子等作用［14］。

图3 孔雀草样品HPLC-DAD图谱

本实验结果表明，模型组小鼠的耳肿胀度、毛细血管通透性、血清中细胞因子TNF-α，IL-6含量与空白组相比明显升高，表明造模成功。而与模型组比较，孔雀草水煎液组、孔雀草挥发油组和孔雀草上清液组小鼠的耳肿胀度、毛细血管通透性、血清中细胞因子TNF-α，IL-6含量明显降低。这表明孔雀草水煎液、挥发油及上清液中含有的成分具有一定的抗炎作用。

孔雀草挥发油的组成十分复杂，其主要成分为2-蒈烯和 β-水芹烯，约占 70%，而其他约 30%［15］，中医学理论认为挥发油通常具有发散解表、芳香开窍、理气止痛、清热解毒、杀虫抗菌等作用，现代研究表明挥发油具有祛痰、止咳、平喘、驱风、解热镇痛及抗菌消炎等作用［16-17］。本实验通过孔雀草中单体化合物为对照品，利用对照品与样品保留时间对孔雀草及其组分的HPLC色谱峰进行定性分析，发现孔雀草茎叶水煎液与上清液组分中主要含有万寿菊素、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷等黄酮类成分化合物，黄酮类化合物通常具有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫等作用［18-19］。故可以认为孔雀草水煎液发挥抗炎活性主要在于其挥发油组分与上清液组分中的总黄酮成分。

本实验通过对孔雀草抗炎活性研究，初步确定了孔雀草的抗炎活性物质为孔雀草挥发油与总黄酮成分，为孔雀草药用价值的深入研究和开发利用奠定了基础。