孙 阳，赵春临

0 引 言

胃癌作为世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在恶性肿瘤中居于第2位［1-2］。中国胃癌的发病率为第 2（32.23/100000），死亡率为第 3（23.90/100000）［3］。尽管手术结合放疗、化疗和靶向治疗延长了生存时间，但晚期胃癌患者的预后依然很差。关键因素是转移机制尚不清楚，没有有效的预测转移的标志物。因此，从分子水平探讨胃癌的转移机制，对于延长晚期胃癌患者的生存时间具有重要意义。纤维连接蛋白（Fibronectin 1，FN1）在细胞基质和细胞-细胞黏附、细胞迁移、形态发生、分化和癌变中起重要作用［4］。上皮肿瘤的上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）与癌细胞向周围微环境的进展和侵袭以及化学抗性表型有关，在EMT过程中上皮癌细胞中上调的FN1已被用作检测癌症EMT表型的间充质标记［5］。研究表明在癌症（如乳腺癌和肺癌）中与其整合素受体α5β1结合来激活PI3K/Akt途径［6-7］。FN1参与癌症发生发展的机制尚不清楚，且FN1在胃癌中的表达和作用报道较少。因此，本研究利用在线肿瘤相关基因表达汇编（the gene expression omnibus，GEO）和癌症和肿瘤基因表达图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据，Kaplan Meier plotter在线生存分析、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）等方法分析FN1在胃癌组织中的表达、临床病理关系、预后和可能参与的信号通路。

1 资料与方法

1.1 资料收集从人类GEO数据库下载GSE54129和GSE29272数据（原始数据运用TAC4.0进行标准化）。从TCGA数据库下载TCGA.STAD.sampleMap/HiSeqV2_PANCA数据（已经标准化处理）。使用Kaplan Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）在线生存分析数据中的胃癌GEO数据集进行生存分析。

1.2 数据集筛选GSE54129和GSE29272数据临床信息不全仅用于mRNA表达对比分析。在TCGA数据库中仅分析临床资料和生存信息完整的患者，TCGA数据共纳入胃癌患者358例，中位年龄67岁，男230例、女128例。TNM分期：Ⅰ期49例、Ⅱ期115例、Ⅲ期160例、Ⅳ期34例。根据表达谱数据FN1表达分为：低表达（＜-0.475）、中表达（-0.475～1.036）、高表达（＞1.036）。Kaplan-Meier Plotter数据来自GEO下载的mRNA数据，共876例胃癌用于生存分析。

1.3 基因集富集分析采用GSEA3.0版本软件进行分析。根据TCGA数据中FN1的表达水平分为低表达（＜-0.898）和高表达（＞1.271）。从GSEA网站的MSIGDB数据库中获得了C6AL.V2.2.GMT和C2.CP.KEG.V5.2.GMT数据集作为参照基因集，分析FN1高表达（＜-0.898）和低表达（＞1.271）对各参照基因集的影响。运行GSEA设置随机组合次数为1000次。在GSEA中P＜0.05且错误发现率（FDR）＜0.25的基因集为显著富集基因集。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料采用频数描述，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验进行比较。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织FN1表达GSE54129数据中胃癌患者111例和正常胃黏膜21例，变异倍数8.86（P＜0.01）。GSE29272 数据中134对癌和癌旁组织，变异倍数 4.01（P＜0.01）。TCGA数据中胃癌癌组织中FN1的表达明显高于癌旁组织（0.120 vs-1.167），差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 FN1表达与临床病理学相关性TCGA数据中FN1表达水平与年龄、肿瘤浸润深度、分化程度、组织学分型相关（P＜0.001）。肿瘤恶性程度越高，FN1表达越高，见表1。

2.3 FN1表达与胃癌预后TCGA数据集和Kaplan-Meier Plotter在线数据（包括GEO数据）的生存分析表明，TCGA数据集中FN1低、中、高表达的中位生存时间分别为63.5、55.7和39.4个月，低表达和高表达者中位生存时间差异有统计学意义（P＜0.01）。Kaplan-Meier Plotter在线数据集分析结果显示，FN1高表达者中位生存时间短于低表达者（P＜0.01）。即FN1表达越高，预后越差。见图1。TCGA数据库中Cox比例风险模型分析显示，FN1的表达是胃癌患者的独立预后因素（HR=0.480，95%CI：0.336～0.686）。见表2。

2.4 FN1的功能基因集富集GSEA法结果提示FN1高表达样本富集到KRAS（FDR=0.0025）、P53（FDR=0.0052）、TGF-β（FDR=0.0052）、细胞黏附（FDR=0.0）、细胞外基质（FDR=0.0043）、骨架蛋白调 控（FDR=0.0057）等 基 因 集（P 均 ＜0.01）。见图2。

表1 胃癌患者中FN1表达与临床病理特征的关系［n（%）］Table 1 Relationship between the expression of FN1 and clinicalpathological characteristics n（%）

图1 胃癌患者FN1表达与胃癌预后生存分析Figure 1 Correlation of FN1 expression and prognosis in gastric cancer

表2 胃癌患者不同预后因素的单变量和多变量分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of different prognostic factors in GC patients

图2 胃癌患者GSEA分析FN1的相关富集基因集Figure 2 GSEA analysis of FN1 enriched gene sets

3 讨 论

FN1是一种参与细胞黏附、迁移及多种信号转导的糖蛋白，并且FN1是多种癌细胞形成和发展的重要调节因子［9-19］，目前FN1已被用作检测EMT标记物［12］。本研究的实验方法和赵文甲等［20］和刘健等［21］的实验方法一致，利用在线数据库分析FN1在胃癌中的作用，结果显示FN1在胃癌中表达升高，这与Xu等［22］报道一致。Cai等［13］揭示了在CRC（结直肠癌）患者中FN1表达水平与年龄，淋巴血管侵犯和存活时间显着相关，本研究同样显示FN1在胃癌中与浸润深度和分化程度相关。临床研究还表明，FN1的高表达与肾癌的生存率低密切相关［14］，本研究发现FN1在胃癌中也是如此。本研究还显示不同组织学分型表达具有显著差异性，在其它肿瘤中并未见报道，可以进行深一步研究关于组织学的差异性。

信号通路是恶性肿瘤的研究重点，现在研究肿瘤的发生机制主要通过研究信号通路的调节，与肿瘤相关的有很多，如JAK-STAT信号通路、p53信号等。FN1通过调节A431-III细胞中MMP-9、MMP-1、整合素β1和β3通路蛋白［11］，VEGF通路［15］，PI-3K/Akt2通路［18］等。有研究表明FN1过表达可以通过激活MMP2/MMP9（EMT通路）途径促进胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭［21-22］。本研究采用GSEA的方法研究FN1参与的信号通路，本研究采用GSEA法研究FN1的表达与KRAS、P53、TGF-β、细胞黏附、ECM、细胞骨架蛋白调节途径有关。推测FN1可能通过参与细胞侵袭和转移而影响生存。证实FN1可作为预后指标，可作为肿瘤治疗的潜在靶点。由于本研究利用TCGA提供的第二代mRNA测序数据和GEO数据库对FN1在mRNA水平上的表达进行分析，因此不能完全反映蛋白表达的结果。然而，样本量大、临床资料完整、可靠性高，在一定程度上具有代表性意义，为进一步的研究提供线索和依据。在随后研究中，将进一步使用IHC、RTPCR和WB进一步验证和分析其预后意义、作用及机制。

综上所述，本研究利用TCGA及GEO数据库检测出胃癌组织FN1表达高于癌旁组织，FN1的高表达是胃癌预后不良的因素，可作为预测胃癌转移和预后的有效生物标志物；FN1高表达导致KRAS、P53、TGF-β、ECM、细胞黏附和细胞骨架蛋白基因通路异常可能是其作用机制。