卢晓倩，陈先侠，王海霞，苏双艳，陈晓宇

0 引 言

凶险性前置胎盘（pernicious placenta previa，PPP）指既往有剖宫产史或子宫肌瘤剔除术史，此次妊娠为前置胎盘，胎盘附着于原手术瘢痕部位者，发生胎盘粘连、植入和致命性大出血的风险高［1-2］。PPP常导致致命性的产后大出血、器官丢失率增加，严重威胁孕产妇的生命安全。研究表明，PPP患者机体处于应激状态，真核生物细胞内的线粒体锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和去乙酰化酶（sirtuins，SIRTs）家族中的去乙酰化酶SIRT3可使MnSOD脱乙酰化，进而活化MnSOD，从而使得超氧阴离子自由基转化为H2O2和O2，降低线粒体氧自由基（ROS）生成，调节线粒体的能量代谢和抗氧化损伤［3］。本研究通过检测MnSOD与SIRT3在PPP伴胎盘植入患者中的表达，以期为探讨胎盘植入发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2014年1月至2018年6月我院住院分娩的PPP合并胎盘植入患者90例，患者均具有前次剖宫产手术史，并根据第9版教科书按照胎盘绒毛侵入子宫肌层深度分为30例胎盘粘连患者（粘连组）、30例胎盘植入患者（植入组）及30例穿透性胎盘植入患者（穿透组）。选取同时期正常分娩的孕产妇胎盘组织30例（对照组）。本次研究通过安徽省妇幼保健院医学伦理委员会批准同意［批准文号：2013（10）］，研究组和对照组孕产妇及其家属均签署知情同意书。

1.2 诊断标准参照2016年欧洲异常侵入性胎盘工作组关于《异常侵袭性胎盘超声描述标准化建议》对PPP进行诊断：①子宫浆膜与膀胱后壁交界面丰富血流信号；②胎盘下（胎盘床）的丰富血流信号；③胎盘内的穿支（腔隙）血流，连接子宫肌层甚至膀胱；④湍流的血流信号流入胎盘漩涡，伴有高速血流频谱；⑤胎盘与子宫壁间存在垂直穿梭的吻合支（诊断结果由产科医师和超声医师共同评估而得出）［4］。胎盘植入诊断标准设定为剖宫产术中胎盘主体附着部位于子宫下段处，胎儿娩出后胎盘不能自行剥离或人工剥离不能完全剥离者。术后病理学诊断标准为子宫平滑肌肌层内存在绒毛组织。

1.3 方法

1.3.1 标本与试剂胎盘娩出后，迅速取胎盘母体面的胎盘组织2块（大小约为1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm）。取材时，对照组选取母体面胎盘中间带部位，植入组选取胎盘粘连、植入部位，同时注意避开出血、坏死、钙化处。使用Western blot检测组织迅速置于-80℃冰箱中保存备用；另一块标本常规处理，制备石蜡切片并进行免疫组织化学法检测，标本固定于4%甲醛溶液。主要相关的试剂包括兔抗人MnSOD、SIRT3多克隆抗体（购于美国Santa Cruz公司），即用型SP免疫组化和二氨基联苯（DAB）显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3.2 免疫组化检测MnSOD、SIRT3表达及判定采用免疫组织化学SP法检测蛋白表达，操作步骤严格按照使用说明书进行。胎盘组织常规脱水、石蜡包埋，厚4 μm连续切片，烤片、脱蜡、微波抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗（1∶100稀释）50 μL，4℃孵育过夜，冲洗后滴加生物素标记的二抗（1∶200稀释）50 μL，滴加DAB工作液显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗为阴性对照。利用Nikon 4500显微镜摄片，MnSOD、SIRT3表达阳性结果为细胞质或胞核染色成棕黄色，每张切片随机选取5个200倍视野，计数阳性染色细胞数。

1.3.3 Western blot分析 MnSOD、SIRT3表达取出低温保存的胎盘组织，在玻璃匀浆器中，加入1%体积分数的RIPA裂解液进行匀浆，冰水中超声破裂，4℃、以12 000 r/min转速离心5 min，离心半径10 cm。取上清液提取蛋白，应用BCA法进行蛋白质定量，蛋白样品煮沸变性，SDS-PAGE电泳，分别加入兔抗人MnSOD、SIRT3和β-actin多克隆抗体（均为1∶1500稀释），蛋白质湿法转移至硝酸纤维素膜，生物素化羊抗兔二抗（1∶2000稀释），室温孵育2 h，ECL化学发光法显色，Image J凝胶成像分析系统扫描成像，测定目标条带的光密度值，以β-actin为内参，比较同一胎盘组织条带与β-actin的光密度值，进行半定量分析。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料均采用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者一般情况比较本组PPP合并胎盘植入患者年龄26～44岁，分娩孕周30+3～39+4周；对照组患者年龄21～31 岁，孕周 34+6～41+2周。穿透组患者年龄、孕次及人流次数均显著高于粘连组和植入组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3组分娩的凶险性前置胎盘合并胎盘植入患者一般资料比较(xˉ±s)Table 1 Comparison of baseline characteristics in three groups(xˉ±s)

2.2 胎盘组织中MnSOD、SIRT3的免疫组化表达情况免疫组织化学SP染色结果显示，MnSOD、SIRT3阳性染色结果在对照组表达较高，主要位于胎盘平滑肌细胞和绒毛细胞的胞质内或细胞核；而PPP合并胎盘植入患者表达明显降低，且MnSOD、SIRT3阳性染色表达与胎盘植入程度之间存在一定关联。见图1、图2。

图1 胎盘组织MnSOD蛋白表达（SP×200）Figure1 ExpressionofMnSODproteininplacenta（SP ×200）

图2 胎盘组织中SIRT3蛋白表达（SP×200）Figure 2 ExpressionofSIRT3proteininplacenta（SP×200）

2.3 Western blot检测胎盘组织中MnSOD、SIRT3蛋白表达情况Western blot结果显示，对照组MnSOD与SIRT3蛋白表达灰度值较高，而粘连组、植入组、穿透组表达较低，见图3。Image J凝胶成像分析软件分析表明，对照组MnSOD/β-actin、SIRT3/β-actin均显著高于粘连组、植入组和穿透组胎盘组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

图3 不同组胎盘组织蛋白表达Western blot图Figure 3 Western blot of different proteins in placenta

表2 胎盘组织中MnSOD/β-actin与SIRT3/β-actin相对蛋白表达比较(xˉ±s)Table 2 Expression of relative proteins of MnSOD and SIRT3 in placenta(xˉ±s)

3 讨 论

PPP发生率不断上升，其中既往仅有1次剖宫产术史者的胎盘植入发生率为11%～27%，剖宫产史≥4次者发生胎盘植入的风险则上升至约67%［5-7］。本研究资料中也证实，剖宫产次数与胎盘植入发生率密切相关。PPP伴胎盘植入因治疗不当会引起严重产后出血，甚至引发母胎死亡等严重不良妊娠结局［8］。为显著改善PPP患者预后，专家建议建立全面处理胎盘植入的多学科团队对孕产妇病情进行全面的评估以制定充分的个性化治疗方案，进而为母胎安全保驾护航［9-10］。

由于前次剖宫产史或子宫肌瘤剔除史导致子宫内膜原有生理结构遭到破坏，进而影响底蜕膜正常发育，使得绒毛易侵袭子宫肌层或浆膜层而形成胎盘植入。因此，近年来国内外众多学者着重于对胎盘植入发病机制的深入研究［10］。相关研究已发现，线粒体是细胞内能量和自由基产生场所，氧自由基清除剂MnSOD可催化超氧阴离子进行歧化反应的作用，而线粒体MnSOD与病理妊娠密切相关［11］。正常妊娠时，MnSOD水平在孕期高于非孕期。氧化应激是指机体内ROS生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态，表现为ROS自由基生成超过抗氧化防御系统，或抗氧化剂活性降低［12］。然而正常妊娠伴随着氧化应激的发生，机体抗氧化酶活性水平呈代偿性升高，使得体内氧化与抗氧化处于动态平衡过程，因而对孕妇本身并无不良影响［12］。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡中起着至关重要的作用，主要是通过催化歧化反应清除体内自由基，是人体内主要的抗氧化物质［13］。当孕妇处于PPP时，胎盘氧化应激损伤加重，此种病理妊娠状态下产生的ROS超出机体的清除能力，进而出现所谓“氧化应激状态”，且ROS生成可以直接损伤抗氧化酶，两者均导致氧化应激损伤增强，损伤产物增加。本研究通过免疫组化SP法和Western blot实验均证实，与对照组相比较，研究组中MnSOD表达逐渐降低，提示胎盘植入患者体内抗氧化能力减弱，间接证明了胎盘植入病理生理发展机制中过氧化反应起着重要作用。由此可认为胎盘组织中抗氧化酶活性水平下降可能是胎盘氧化应激损伤水平升高的原因。

人类 SIRTs家族有 7种亚型（SIRT1-7），其中SIRT3主要位于线粒体，且是唯一具有去乙酰化酶活性的SIRTs，去乙酰化酶SIRT3可以使得线粒体的组蛋白/非组蛋白的乙酰化蛋白去乙酰基，从而增加线粒体氧自由基清除能力，抑制ROS的过多产生和蓄积，使线粒体功能处于稳定状态，进而发挥抗氧化应激作用［14］。SIRT3可以引起MnSOD-122位赖氨酸残基去乙酰化，导致MnSOD活化，降低线粒体ROS产生，从而参与抗氧化应激损伤作用［15］。本实验胎盘组织的免疫组化结果证实，对照组胎盘组织中SIRT3蛋白表达明显升高，说明正常孕妇机体处于氧化应激状态；而PPP研究组胎盘组织中SIRT3蛋白表达明显降低，且随着绒毛膜植入程度的增加，SIRT3蛋白与MnSOD蛋白表达均呈现相似的降低趋势。进一步经Western blot方法检测胎盘组织中MnSOD、SIRT3蛋白表达情况，与免疫组化的表达情况类似，说明在胎盘植入患者机体清除自由基、维持机体细胞内氧化还原平衡状态的能力下降。

综上，本研究结果显示PPP伴胎盘植入孕产妇胎盘组织中MnSOD、SIRT3表达降低，且与病变程度具有一定程度的相关性，结果表明MnSOD、SIRT3两者均参与了胎盘植入的发病过程，有助于对胎盘植入的发病机制进行深入研究，以期改善母婴结局。