刘士明，丁 涛，雷良玉，胡 琳，冒 灵，陈 超，郭萌萌，徐 林

0 引 言

近年来，结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，现居全球癌症的第3位［1-4］。肿瘤转移是结直肠癌患者疗效和预后差的主要原因［5-8］。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有极性的上皮细胞在某些特定的生理或病理情况下向间充质细胞转化的生物学过程。在这一过程中，上皮细胞或组织特性丢失，而获得间质细胞或组织的特性。大量研究显示，肿瘤细胞EMT发生是包括结直肠癌在内的恶性肿瘤细胞获得迁移及侵袭能力的重要机制之一［9-13］。

Ⅰ型辅酶脱氢酶1α亚复合物4（NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4，NDUFA4）是由人类NDUFA4基因编码的线粒体呼吸链蛋白质，其基因定位于人7号染色体p21.3上，总长度为8234个碱基对，分子量约为9400；具有NADH脱氢酶和氧化还原酶活性，能够将电子从NADH转移至呼吸链，参与能量代谢［14-15］。研究显示NDUFA4的异常表达与包括肿瘤在内的多种疾病发生发展密切相关。本研究前期发现NDUFA4过表达可促进人肺癌细胞的增殖和侵袭［16］。然而，NDUFA4在人结直肠癌发生中的可能作用和机制尚未阐明。本研究旨在探讨NDUFA4过表达对EMT的作用。

1材料与方法

1.1 质粒、细胞株和主要试剂人结肠癌HCT116细胞株购自中国生命科学院上海细胞库（TCHu99），质粒p-NDUFA4和质粒p-Cont（空载对照质粒）均由遵义医学院免疫学教研室保存。McCoy′s 5A细胞培养基（货号：16600082）、胎牛血清（16000-044）、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（25300054）均购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、结晶紫染液（G1062）购于北京索莱宝生物科技有限公司；100×三抗（青霉素-链霉素-两性霉素B混合液）购自北京索莱宝科技有限公司（P7630）；Lipofectamine3000（L3000008）试剂购于赛默飞世尔科技公司；Transwell小室、Matrigel胶购自美国康宁Corning Costar公司；MMP2、MMP9、CXCR4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、GAPDH 引物均由上海Sangon Biotech公司合成，总RNA提取试剂盒（DP430）、FastQuant cDNA逆转录合成试剂盒（KR106-01）购自北京天根生物科技有限公司；SYBR®Premix Ex Taq™ Version2.0（RR902A）购于Takara公司；全蛋白提取试剂盒（KGP2100）、ECL显色液（KGP1127）、RIPA裂解液（KGP702）均购自江苏凯基生物技术股份公司；β-Actin（AF0003）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗NDUFA4（Ab129752）、兔抗 E-Cadherin（Ab15148）、N-Cadherin（Ab76011）、SNAIL（Ab180714） 、TWIST（Ab5081）一抗以及鼠抗 Vimentin（Ab8069）一抗、HRP标记的羊抗鼠二抗（A0216）、羊抗兔二抗（A0208）均购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人结肠癌细胞株HCT116选用McCoy′s 5A细胞培养液，其细胞培养液含10%优质胎牛血清（FBS）和三抗（青霉素和链霉素-两性霉素混合液），培养条件为37℃、5%CO2，48 h换1次液，待HCT116细胞融合度达80%～90%时，胰蛋白酶消化细胞，离心后收集细胞进行实验。

1.2.2 重组质粒p-NDUFA4瞬时转染实验将收集的细胞以每孔1×105个细胞均匀接种于6孔板，实验分为p-NDUFA4组（p-NDUFA4重组质粒）、对照组（p-Cont对照质粒），培养细胞，待细胞融合度达到80%左右时，按照Lipofectamine3000转染试剂盒说明书进行转染。次日，使用荧光显微镜观察细胞的转染后形态的变化。

1.2.3 实时荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞中NDUFA4的表达实时荧光定量PCR检测NDUFA4的表达参照文献［16］。细胞蛋白质样品的制备：①倒掉培养液，吸水纸吸干培养液；②每瓶细胞加入3 mL 4℃预冷的PBS，洗涤细胞3次；③每瓶细胞加入400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min；④用干净的刮棒刮掉细胞，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中；⑤4℃12 000 r/min离心5 min；⑥将离心后的上清分装转移到0.5 mL的离心管中，放于-20℃保存。BCA法定量细胞蛋白样品的检测参照文献［16］

1.2.4 划痕实验检测转染细胞的的迁移能力以每孔5×105个细胞分别接种于24孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱常规培养；次日，待细胞贴壁后，用无菌枪头尖端均匀等力在每个孔中垂直画水平线；PBS清洗划线的细胞，并更换新鲜的完全培养基继续培养；48 h时在相差倒置显微镜观察下观察划痕细胞的迁移情况并拍照取样。

1.2.5 Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力采用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/mL，冰上操作；选择8.0 μm孔径的Transwell小室置于24孔板中，将2组处于对数生长期的细胞分别稀释至5×105/mL，每个上室加入100～200 μL细胞悬液，每个下室加入600～800 μL含15%优质胎牛血清的培养液；继续在37℃、5%CO2孵箱培养48 h，弃培养液，用棉签棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，PBS反复漂洗3次，将小室移至10%多聚甲醛室温固定20 min；随后，将小室移至预先加入2%结晶紫溶液中染色，室温染色15～30 min，PBS清洗小室中多余的染料；彻底晾干小室后，于倒置显微镜下随机计数3个视野的细胞、拍照。实验重复3次，取均数。

1.2.6 实时荧光定量 PCR法检测转移相关因子的表达MMP2、MMP9、CXCR4等转移相关因子表达的检测参照文献［16，18-19］，MMP2等引物序列及扩增长度见表1。

1.2.7 Western blot检测EMT转录因子的表达免疫印迹检测Twist、Snail等蛋白的方法参照文献［17］。

1.2.8 免疫荧光法检测各组细胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表达免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin蛋白的方法参照文献［20］。

1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 5.0软件和image J软件统计分析数据。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间均数比较采用t检验，多组间均值比较采用单因素方差分析，两两间比较采用LSD法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NDUFA4在人结直肠癌细胞中的表达情况p-NDUFA4组NDUFA4-mRNA、NDUFA4蛋白相对表达量［（1.94±0.08）%、（1.07±0.12）%］较对照组［（0.96±0.15）%、（0.60±0.05）%］明显上调（P＜0.05），见图1。

表1 转移相关因子引物序列及扩增产物长度Table 1 Primer sequences and amplification product lengths used for real-time quantitative PCR

图1 人结直肠癌HCT116细胞中NDUFA4的表达Figure 1 Expression of NDUFA4 in the human CRC HCT116 cells

2.2 NDUFA4过表达对HCT116细胞迁移能力的影响细胞转染48h时，p-NDUFA4组细胞的体外迁移能力、细胞迁移率［（54.36±4.08）%、（1.85±0.10）%］较 对 照 组［（29.51±3.17）% 、（0.99±0.12）%］明显升高（P＜0.01）。划痕实验结果显示随着时间的推移，2组细胞的划痕间距逐渐变窄，48h时，p-NDUFA4组细胞划痕间距明显高于对照组。Transwell迁移实验显示，p-NDUFA4组穿过人工基底胶细胞数较对照组增多。见图2。表明转染p-NDUFA4重组质粒能够显著促进HCT116细胞的迁移。

图2 NDUFA4过表达对人结直肠癌HCT116细胞的体外迁移的影响Figure 2 Effect of NDUFA4 overexpression on the migration of the huam CRC HCT116 cells

2.3 NDUFA4过表达对HCT116细胞转移相关因子及上皮间质转化分子标志物mRNA表达的影响p-NDUFA4组肿瘤细胞转移相关因子MMP2、MMP9、CXCR4的mRNA表达较对照组显著上调，上皮标记分子E-cadherin mRNA明显下调，而间质标志物N-cadherin、Vimentin，及转录相关因子Snail、Twist的mRNA表达显著上调（P＜0.01）。见表2。

2.4 Western blot检测HCT116细胞中EMT相关蛋白的表达水平p-NDUFA4组E-cadherin蛋白的表达较对照组显著下调、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail的蛋白表达显著上调（P＜0.05）。见图3，表2。

2.5 免疫荧光技术检测细胞中EMT相关蛋白的表达水平细胞免疫荧光结果显示：与对照组相比，p-NDUFA4组细胞中E-cadherin的荧光较弱、表达量明显下调,Vimentin的荧光闪亮，呈明显的红色，表达量明显增加。见图4、图5。

表2 人结直肠癌HCT116细胞中各因子及EMT相关蛋白的表达（xˉ±s，%）Table 2 The mRNA expression levels of in the human CRC HCT116 cells（xˉ±s，%）

图3 Western blot检测人结直肠癌HCT116细胞中EMT相关蛋白的表达Figure 3 Expression levels of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，Twist and Snail proteins in the HCT116 cells

图4 免疫荧光法检测人结直肠癌HCT116细胞中E-cadherin的表达（×400）Figure 4 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells（IFA ×400）

图5 免疫荧光法检测人结直肠癌HCT116细胞中Vimentin的表达（×400）Figure 5 Expressions of E-cadherin and Vimentin in the human CRC HCT116 cells（IFA ×400）

3 讨 论

结直肠癌细胞的EMT过程与其转移和侵袭密切相关。因此，探讨结直肠癌细胞EMT发生机制，不仅对进一步阐明结直肠癌的恶性生物学行为，且对于CRC靶向治疗新策略开发均有着重要的理论价值和临床意义。相关文献报道，线粒体复合物关键酶NADH脱氢酶（辅酶）1α亚基（NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex，NDUFA）家族在机体组织器官发育和临床肿瘤发生发展中发挥着重要的作用［21-23］。近年来，随着对NDUFA4研究的不断深入，NDUFA家族分子在多种恶性肿瘤发挥的作用正逐渐被揭示。例如，NDUFA13在人肺癌组织中表达量明显下降，与肿瘤增殖和转移等恶性生物学行为存在密切联系［24-26］。有研究发现，癌基因Ras能够直接下调肝组织线粒体复合物关键酶NADH脱氢酶（辅酶）1α亚基12（NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 12，Ndufa12）的表达，导致线粒体功能障碍并上调细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，进而促进肝癌的发生发展。这些研究提示NDUFA家族分子参与肿瘤发生过程的复杂性［27］。因此，深入探讨不同NDUFA家族分子在特定肿瘤发生中的作用，不仅有利于NDUFA家族分子生物学功能的解析，而且对于相关肿瘤发生机制认识和临床生物防治新策略开发均具有重要意义。

近来研究显示，作为NDUFA家族成员之一，NDUFA4也参与了肿瘤的发生过程［28］。本研究前期发现，微小RNA-7分子在体外可显著抑制肺癌中NDUFA4的表达，且过表达NDUFA4可促进人肺癌细胞的侵袭和迁移。本研究观察到，在人结直肠癌细胞中过表达NDUFA4，可显著促进HCT116细胞的迁移能力，同时肿瘤细胞转移相关因子MMP2、MMP9和CXCR4的表达均明显上调，提示NDUFA可显著促进人结直肠癌细胞体外转移能力。为了进一步分析NDUFA对人结直肠癌细胞EMT发生的影响，本研究进一步检测了细胞中EMT转录相关蛋白和转录因子的表达，发现上皮标志物E-cadherin明显下调，间质标志物N-cadherin、Vimentin，及转录相关因子Snail、Twist表达显著上调。周宇箭等［29］报道，核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor，RI）基因过表达可显著促进小鼠黑色素瘤B16-F10细胞EMT的发生，从而增强癌细胞的侵袭和转移能力，可能与其转录调节因子snail、Twistl等的表达密切相关。和本研究结果一致。均提示NDUFA4可能是人结直肠癌EMT发生中的新调控分子，其通过对转录因子Snail、Twist的表达调控，使EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达发生改变，从而促进EMT的发生，导致肿瘤细胞转移。然而，其相关确切机制仍有待后续研究阐明。

综上所述，本研究发现NDUFA4可促进人结直肠癌细胞的EMT的发生。为后续人结肠癌转移发生机制的研究，以及相关临床治疗策略开发提供了重要的前期基础。