吕 幸，吴维青，崔英霞，陈芳芳，孙 宁，姚新月，夏正坤，刘志红，李晓军

0 引 言

Alport综合征（Alport Syndrome，AS）作为常见的遗传性肾小球疾病，临床主要表现为血尿伴或不伴蛋白尿和进行性肾功能衰竭，部分患者还患有感音神经性耳聋或眼部异常［1-2］。AS由于编码Ⅳ型胶原α链的基因——COL4A5、COL4A4、COL4A3发生突变引起，根据遗传方式的不同可以分为X连锁显性遗传Alport综合征（XLAS，OMIM no.301050），常染色体隐性遗传Alport综合征（ARAS OMIM no.104200）以及常染色体显性遗传Alport综合征（ADAS OMIM no.203780）［3-4］。COL4A5 基因突变造成的 XLAS 是最常见的Alport综合征，约占总发病率的85%［5-6］。

目前超过1168种COL4A5基因突变已被发现，其中剪接突变约占20%［7］。研究认为，实际的剪接突变远不止如此，大多数已报道的突变未在RNA水平进行分析，一些错义突变、无义突变，甚至同义突变也可能影响pre-mRNA的剪接过程［8-10］。对AS患者的可疑基因变异进行功能性分析有助于阐明其发病的分子机制。

本研究通过目标序列捕获联合高通量测序技术对一个中国Alport家系进行基因检测，发现一个新的COL4A5基因突变，体外Minigene实验证明此突变影响pre-mRNA的剪接过程。

1 资料与方法

1.1 研究对象先证者，女，9岁，因血尿伴蛋白尿50天就诊于我院儿科。常规检查示：尿红细胞计数859.3/μL↑、尿蛋白定量3.34 g/24h↑。听力及眼底检查未发现异常。肾穿刺活检术光镜下15个肾小球中2个节段硬化，余肾小球偶见系膜区轻度增宽，囊壁节段增厚。肾小管间质轻度慢性病变，多灶性萎缩、基膜增厚，肾小管上皮细胞细颗粒变性，间质纤维化伴少量单个核细胞浸润，见大量泡沫细胞多灶性分布。电镜下显示肾小球系膜区偶见增宽，基膜偏薄（60%～70%）。厚度 130～250 nm，较厚处250～460 nm，基膜致密层未见撕裂分层。肾小球足细胞足突广泛融合（50%～60%）。免疫荧光检查见肾小球IgM+弥漫分布，呈颗粒状沉积于系膜区。肾组织冰冻切片Ⅳ型胶原检查：α3、α5链均节段缺失。根据患者临床表现及病理检查结果，该患儿高度疑诊为Alport综合征。临床建议行基因检测明确诊断。

1.2 家系调查和样本收集对患儿3代以内的亲属进行家系调查，包括年龄、性别、患病情况等，绘制家系图。本研究经医院伦理委员会批准（批准文号：2015NZKY-007-004），获得患儿及家属知情同意后采集家系内共8人外周静脉血。

1.3 高通量测序及家系验证按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取患儿及家属全基因组DNA。本实验前期设计并制定了包含78个常见遗传性肾病相关致病基因的液相探针捕获芯片，包括COL4A3、COL4A4、COL4A5基因在内［11］。应用此目标序列捕获芯片联合高通量测序技术检测78个相关基因外显子是否存在可疑致病突变，检出的可突变与千人数据库、dbSNP数据库、ESP外显子数据库及华大本地数据库进行比对。应用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster软件进行突变功能预测。Phylop软件用于SNPs保守性预测。对8位家系成员进行Sanger测序。针对检测出的变异位点设计特异引物进行PCR扩增，见表1。扩增产物采用ABI3730xl DNA测序仪进行双端测序，并比对分析测序结果。

1.4 剪接突变预测采用在线分析软件Human Splicing Finder3.0、MutPredSplice预测突变对剪接过程的影响。

1.5 Minigene技术

1.5.1 质粒构建以患者或正常家系成员的基因组DNA为模板，根据基因变异位点设计特异性引物对COL4A5基因外显子32、33，内含子32及上下游侧翼序列（1408bp）进行PCR扩增，见表1。在1.5%琼脂糖凝胶上进行PCR产物纯度检测，并切胶纯化得到目的片段。将PCAS2质粒（中国医学科学院基础医学研究所张学教授赠予）通过BamH1酶（酶切位点位于外显子A、B之间）酶切后进行胶回收纯化。然后将目的片段和酶切质粒用连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经LB固体培养基增殖12 h后，挑选单克隆菌落并进行质粒提取。经测序验证后，分别得到野生型质粒PCAS2-WT和突变型质粒PCAS2-MT。

1.5.2 细胞培养以及转染实验将293T细胞在90%DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2条件下进行培养，细胞在六孔板上培养至60%～85%后进行转染。按照Jet Primer试剂说明书，分别将PCAS2-WT、PCAS2-MT转染至293T细胞中，培养24 h。

表1 PCR扩增引物Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.5.3 转录产物分析将转染24 h后的293T细胞用TRIZOL提取RNA，置于-80℃保存。将RNA反转录为cDNA。设计逆转录引物，以cDNA为模板进行RT-PCR，见表1。转录产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察PCAS2-WT、PCAS2-MT片段长度变化；并对产物进行Sanger测序，与参考序列进行比对分析。

2 结 果

2.1 家系调查该家系3代共10名成员，其中Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2均发现血尿，同时Ⅰ-2、Ⅲ-1合并有蛋白尿，家系成员血压及肾功能均正常。家系内否认近亲结婚史。家系图见图1。

图1 一个中国Alport综合征家系系谱图Figure 1 Pedigree diagram of the Chinese family with Alport syndrome

2.2 基因分析先证者（Ⅲ-1）检测出一COL4A5基因杂合变异c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。Sanger测序显示此家系中所有患者（Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2）均携带c.2767G＞T杂合变异，而其他成员未检出此变异，呈现家系共分离现象。生物信息学分析表明，COL4A5 c.2767G＞T为错义突变，造成Ⅳ型胶原α5链第923位甘氨酸置换为半胱氨酸，该变异在千人数据库，dbSNP数据库，ESP6500数据库及华大基因本地数据库中均未检出，SIFT、PolyPhen-2、Mutation-Taster预测均为有害变异，Phylop软件预测此突变位点在灵长类、脊椎动物及哺乳动物分值分别为0.594、5.903、2.466，均为保守序列。根据ACMG标准，此变异属于可能致病性变异［12］。经检索人类基因突变数据库和文献，此基因变异未见报道，为新发现的基因变异。

HSF3.0预测此突变可能通过破坏野生型供体剪接位点、外显子剪接增强子或产生新的外显子剪接沉默子等途径影响剪接过程；MutPredSplice预测该错义变异影响剪接分值为0.9分，可能为剪接变异。

2.3 Minigene实验转录产物经电泳得到两条不同长度的条带，见图2。PCAS2-WT转录产物与预期的长度450bp一致；而PCAS2-MT转录产物条带低于450bp，说明突变型质粒发生了剪接变化，得到了不同的转录产物。

图2 Minigene实验RT-PCR转录产物分析Figure 2 RT-PCR transcription products of minigene assay

测序结果与参考序列进行对比分析，发现PCAS2-WT转录产物序列为外显子A、外显子32、33和外显子B，而PCAS2-MT转录产物序列为外显子A、外显子33和外显子B，见图3。因此，COL4A5基因上c.2767G＞T变异在293T细胞上造成32号外显子缺失。

图3 Minigene实验RT-PCR转录产物分析Figure 3 RT-PCR transcription products of minigene assay

3 讨 论

19 世纪，Fliter［1］和 Gregory等［13］分别提出了 AS的临床诊断标准，通过临床表现、家族史，结合肾组织病理检查和Ⅳ型胶原α链染色，大多数病例可明确诊断。然而在实际的临床工作中，幼年及女性AS患者常呈现不典型的肾组织病理改变，且部分患者缺乏肾外表现，故基因诊断是确诊Alport综合征的有效手段［14-15］。

AS是由于编码Ⅳ型胶原α链的基因COL4An基因发生突变导致，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因分别含有52、48、51个外显子，基因庞大且无热点突变，传统的Sanger测序耗费人力、物力，因此目标序列捕获测序技术应运而生，成为一种高效、低成本的基因诊断方法。此前，本课题组设计了包含78个遗传性肾病相关基因的捕获芯片，联合高通量测序技术，对遗传性肾病患者进行检测，能在较短的周期内发现大多数患者的基因突变［11，16］。本研究纳入一个临床疑似AS家系，先证者肾活检电镜缺乏典型表现，但肾组织胶原染色异常。为进一步确诊，应用目标序列捕获联合高通量测序技术对先证者进行基因分析，结果发现一个杂合COL4A5基因变异c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。

本研究中发现的COL4A5基因变异c.2767G＞T（p.Gly923Cys），通常认为此类变异是造成单个氨基酸替换的错义突变。但考虑到该突变位于32号外显子最后1位碱基，有可能影响RNA剪接过程。有文献报道，外显子上的错义突变经检测mRNA后证实为剪接突变［17-19］。因此，本研究首先利用软件预测，发现该变异可能影响pre-mRNA剪接。为进一步验证其致病性，进行了体外Minigene实验。结果表明，此突变导致COL4A5基因32号外显子90个碱基完全缺失。COL4A5基因编码产物为Ⅳ型胶原α5链，共有1685个氨基酸，其中富含甘氨酸三联结构（Gly-X-Y）的中间胶原区对维持Ⅳ型胶原三螺旋结构的稳定性有重要作用。c.2767G＞T突变位于胶原编码区，造成了10个Gly-X-Y序列的缺失，可能产生不稳定的Ⅳ型胶原并影响其正常功能。大多数遗传性疾病的突变分析只在基因组DNA水平进行，少有突变通过实验验证其对mRNA表达及剪接过程的影响。在已经DNA和RNA水平验证的错义突变中，约50%的突变被证实产生了异常剪接［20］。除经典剪接位点外，内含子上的分支位点、多聚嘧啶序列，以及外显子和内含子上的剪接增强子（ESE/ISE）和沉默子（ESS/ISS）发生突变均可能影响pre-mRNA剪接［21］。外显子最后1位碱基发生突变可能通过影响临近内含子的5’剪接位点，使得剪接体错误识别，进而产生异常的剪接产物［22］。因此，对外显子及深度内含子上的可疑突变应同时进行DNA和RNA水平的分析，有助于理解疾病的分子发病机制。

确定一个特定的突变是否影响剪接，最直接有效的方法就是提取患者肾或者皮肤组织中的RNA进行分析，而组织提取为侵入性实验。有研究者成功从AS患者的30根发根中提取出RNA进行转录分析［17，23］。遗憾的是，本例患者拒绝提供发根，而外周血中的RNA表达量极低，导致我们无法进行体内RNA水平的分析。因此，本研究仅采用体外Minigene技术分析潜在的剪接突变［24-25］。此前，研究者对其他遗传性肾病基因突变进行分析，发现Minigene实验结果与患者体内RNA表达基本一致，证实Minigene技术是一种简单有效的剪接突变分析方法［26-27］。

总之，本研究通过目标序列捕获芯片联合高通量测序技术在一中国XLAS家系中发现了一个新的COL4A5基因c.2767G＞T外显子杂合突变；并通过体外Minigene实验发现此突变影响mRNA剪接过程，导致COL4A5基因32外显子缺失。