吴映璇，林 峰，陈思敏

（广东检验检疫技术中心，广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623）

近年来频繁发生的乳与乳制品的质量安全事件引起人们对乳制品安全的普遍关注，特别是兽药残留问题[1-6]。寄生虫感染是危害畜禽生产和畜牧业发展的重要疾病之一，其防治以药物为主。常用的防治药物主要为苯并咪唑类药物、咪唑噻唑类和大环内酯类药物等[6-8]，随着药物的广泛使用，不可避免的出现了耐药性问题[9-10]。莫奈太尔是一种新型氨基乙腈衍生物类驱虫药，经口给药后，在动物体内被快速吸收并快速氧化为亚砜，亚砜又进一步被氧化为砜，莫奈太尔及其代谢物的化学结构式见图1。该药物特定地作用于线虫特有的烟碱乙酰胆碱受体亚科ACR-23蛋白，具有快速、高效和渗透性神经肌肉效应，通过引起体壁肌肉过度收缩导致咽前部麻痹、痉挛性收缩并最终死亡，可以有效杀灭耐受其他类别药物的线虫。国外已有大量研究表明该药具有较好的驱虫效果，同时还制定莫奈太尔的最大残留限量[11-29]。欧盟37/2010规定：莫奈太尔在牛、羊乳中的最大残留限量为0.17 mg/kg[30]。我国尚未制定出莫奈太尔的最大残留限量。

图1 莫奈太尔及其代谢物的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of monepantel and its metabolites

目前，国外已有关于动物组织中的莫奈太尔和莫奈太尔砜的相关报道[31]，乳制品中莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的相关研究鲜见报道。因此，为保障食品安全，尤其是孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康，建立快速准确测定乳制品中的莫奈太尔及其代谢物残留量的检测方法已迫在眉睫。本方法采用高效液相色谱-串联四极杆质谱结合液液萃取净化等技术，建立乳制品中莫奈太尔及其代谢物的检测方法；采用基质标准曲线校正定量结果，以减少基质效应对测定结果的精密度和准确度的影响。该方法操作简便、前处理成本低、灵敏度高、抗干扰能力强、定性定量准确，能够为牛乳和乳粉等乳制品中莫奈太尔及其代谢物莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的分布状况的监测工作提供技术支持，为我国建立莫奈太尔的最大残留限量提供数据支持与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳、乳粉 广州市购。

莫奈太尔、莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜 美国Witega公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Tedia公司；乙酸铵（优级纯） 印度Fluka公司；去离子水由Millipore公司超纯水机制得；中性氧化铝固相萃取柱（1 g/3 mL） 美国色谱科公司，用3 mL乙腈活化，备用。

1.2 仪器与设备

UFLC LC-20A超高效液相色谱仪 日本岛津公司；4000 QTRAP三重四极杆串联质谱仪（配电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）离子源） 美国AB Sciex公司；吹氮浓缩仪 美国Zymark Turbovap.LV公司；涡旋振荡器 德国IKA公司；3-16K型高速离心机德国Sigma公司；超纯水机 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液的配制：分别准确称取适量莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜标准品置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100 mg/L的标准储备液，－18 ℃冰箱保存。

混合标准中间液（10 mg/L）：分别吸取适量的标准储备液至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制质量浓度为10 mg/L标准中间液。

标准工作液的配制：准确吸取一定量的10 mg/L标准中间液，用甲醇逐级稀释配制成100 μg/L的标准工作液。

标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L系列标准溶液。

定容液：量取90 mL甲醇和10 mL 0.5 mmol/L乙酸铵溶液，摇匀备用。

1.3.2 样品处理与净化

称取乳粉0.5 g（精确至0.01 g）至50 mL的离心管A中，加入2 mL水涡旋振荡至溶解样品完全（牛乳试样2 g），加入5 mL饱和氯化钠，涡旋振荡2 min，加入10 mL乙腈，涡旋振荡10 min，超声10 min，提取液以4 000 r/min离心5 min。上清液转移至另一50 mL离心管B中。离心管A中加入8 mL乙腈重复提取一次，4 000 r/min离心5 min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至20 mL刻度，摇匀。吸取8 mL（牛乳2 mL）样品提取液50 ℃吹氮浓缩至干。残渣用定容液溶解并定容至2.0 mL，涡旋振荡1 min，超声5 min。加入5 mL正己烷涡旋振荡0.5 min，3 000 r/min离心5 min，弃去上层溶液，再用正己烷重复脱脂一次，下层溶液50 ℃吹氮浓缩至干。残渣用定容液溶解并定容至2.0 mL，涡旋振荡1 min，超声5 min，经0.2 μm滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱测定。

1.3.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Inertsil C8（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：A甲醇+B 0.5 mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱：0～3 min、10%～95% A，3～5 min、95% A，5～5.1 min、95%～10% A，5.1～10 min、10% A；流速0.30 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；气帘气压力：173 kPa；雾化气压力：345 kPa；辅助加热气压力：449 kPa；碰撞气压力：76 kPa；喷雾电压：－4 500 V；离子源温度：400 ℃；莫奈太尔及其代谢物的相关质谱参数见表1。

表1 莫奈太尔及其代谢物质谱参数Table 1 Mass spectrometric conditions for the analysis of monepantel and its metabolite standards

1.4 数据处理及图像处理方法

数据及图像处理软件分别是Analyst 1.6.3以及JMP。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

莫奈太尔几乎不溶于水，微溶于丙二醇和正辛醇，溶于乙醇，易溶于二氯甲烷和聚乙二醇[11]，本实验选取极性不等的3 种溶剂二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈进行提取实验。结果发现，乙酸乙酯提取时容易发生乳化，且提取效率最低；二氯甲烷次之；乙腈的提取效率最高，牛乳样品中3 种药物的回收率在85.5%～100.2%之间，乳粉样品中的提取效率稍低，为65.7%～80.3%。究其原因，乙腈加入乳粉样品后，蛋白沉淀迅速，待测物质被沉淀的蛋白包裹成团，乙腈提取难以浸润到基质内部，降低了提取效率。因此，本实验着重考察乳粉样品的提取实验，选取称样量为0.5、1.0 g和2.0 g乳粉样品进行提取，分别加入2 mL水，结果发现，2 mL水能够将0.5 g乳粉溶解完全；1.0 g乳粉未能溶解完全，再加入2 mL水涡旋振荡后能够溶解完全；称样量为2.0 g的乳粉，加水后结块严重，需要继续增加水的体积才能溶解完全。鉴于乳粉是采用喷雾干燥后一次成粉的生产工艺，不存在不均匀的风险，同时减少实验中提取溶剂的用量，本实验最终选择乳粉的称样量为0.5 g进行实验，加入2 mL水将样品溶解完全，再加入饱和氯化钠，不但起到分散的作用，还能沉淀部分蛋白，最后再用乙腈提取，结果发现，乳粉样品中各药物的提取效率在79.5～92.9%之间；同样，牛乳样品加入饱和氯化钠，再用乙腈提取也得到很好的回收率效果，回收率为97.0%～102.9%。综合考虑各因素，本实验选择水-饱和氯化钠-乙腈作为液态乳和乳粉的提取溶剂。

2.2 色谱柱的选择

本实验在相同的色谱分离条件下分别考察Inertsil C8柱、Atlantis Hillic柱和Atlantis T3柱。结果显示：采用Atlantis Hillic柱进行分离时，莫奈太尔及其代谢物在1.8 min处完成分离，峰形严重拖尾且开叉，峰宽0.8 min。采用Atlantis T3柱进行分离时，莫奈太尔及其代谢物在8 min处开始分离，峰形较差，峰宽0.4～0.6 min。而在Inertsil C8柱上获得了理想的分离效果，峰形尖锐对称，峰宽0.25 min。因此，本实验选择Inertsil C8柱。

2.3 流动相的选择

流动相的组成与色谱柱及被分离的组分有关，流动相的洗脱能力由其极性决定，强极性的流动相占据吸附中心的能力强，其洗脱能力强，使组分的k值小，保留时间短[32]。对于电喷雾质谱的负离子模式，流动相只能选择pH值较高的具有可挥发性的盐类或者水。本实验考察甲醇、乙腈和水、不同浓度的乙酸铵溶液进行多种组合，研究发现，采用甲醇作为有机相时莫奈太尔及其代谢物的灵敏度优于乙腈；当水相乙酸铵浓度高于0.5 mmol/L时，莫奈太尔及其代谢物灵敏度下降。另外还考察甲醇-水体系和甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵体系的色谱分离情况：采用甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵体系进行分离时莫奈太尔和莫奈太尔亚砜的灵敏度比甲醇-水体系增强了18%和16%，莫奈太尔砜则没有明显变化。综合考虑分离度、保留时间和色谱峰形等因素，本实验最终选择甲醇-0.5 mmol/L乙酸铵为流动相，分离结果见图2。

图2 莫奈太尔及其代谢物MRM色谱图Fig. 2 Chromatograms of monepantel and its metabolite standard solution in MRM mode

2.4 质谱条件的优化

图3 莫奈太尔及其代谢物的二级离子碎片扫描质谱图Fig. 3 Tandem mass spectra of monepantel and its metabolite

用蠕动泵以10 μL/min的流速分别连续注射0.5 mg/L的莫奈太尔及其代谢物标准溶液入ESI离子源中，在负离子检测模式下对莫奈太尔及其代谢物进行一级质谱分析，得到莫奈太尔及其代谢物准分子离子峰：莫奈太尔准分子离子峰（m/z472）、莫奈太尔亚砜准分子离子峰（m/z488）和莫奈太尔砜准分子离子峰（m/z504）。分别对准分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，莫奈太尔的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，莫奈太尔亚砜的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，莫奈太尔砜的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，最终选择响应高、基线噪音低的离子对m/z472/186、m/z488/186和m/z504/186为定量离子对。莫奈太尔及其代谢物的二级质谱图见图3。

2.5 线性范围和定量限测定结果

在1.3.3节和1.3.4节条件下，取一系列不同质量浓度的莫奈太尔及其代谢物标准溶液（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L），以莫奈太尔及其代谢物响应峰面积（y）对莫奈太尔及其代谢物的质量浓度（x）进行线性回归，分别比较莫奈太尔及其代谢物在0～20、0～10、0～5.0 μg/L范围内的线性关系、相关系数和标准溶液的测定值与实际值的比值（以0.2 μg/L的标准溶液为例）。结果表明，莫奈太尔及其代谢物在这3 个线性范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.999，但是标准溶液0.2 μg/L的测定值与实际值的比值分别为52.0%～64.5%、85.5%～86.0%和93.0%～99.5%，因此当莫奈太尔及其代谢物的线性范围为0～20 μg/L和0～10 μg/L时，样品前处理后上机溶液质量浓度接近0.2 μg/L时，测定值偏低，容易造成结果不准确，采用0～5.0 μg/L的线性范围进行定量时，测定值接近实际值，定量更为准确，故莫奈太尔及其代谢物采用0～5.0 μg/L的线性范围，详见表2。

表2 莫奈太尔及其代谢产物线性方程Table 2 Calibration equations for monepantel and its metabolites in milk and milk powder

本实验选择空白的乳制品样品，当添加量为2.0 μg/kg时，信噪比大于10，表明其定量限可达到2.0 μg/kg，空白样品及加标定量限样品总离子流图见图4。当样品中的莫奈太尔及其代谢物含量超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。

2.6 方法的回收率和精密度实验结果

选用未含有莫奈太尔及其代谢物的牛乳和乳粉样品分别进行添加回收率和精密度实验，添加量为2.0、4.0、20 μg/kg，按1.3.2节方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6 次，计算添加回收率及相对标准偏差，结果见表3。3 个添加水平的平均回收率在79.5%～102.9%之间，相对标准偏差为2.0%～5.3%。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。

3 乳制品中莫奈太尔及其代谢物的加标回收率与精密度（ =6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for monepantel and its metabolite in dairy products ( = 6)

2.7 实际样品的测定结果

按照本研究所建立的方法对目前市场销售的18 份牛乳和15 份乳粉样品进行测定，均未检出莫奈太尔及其代谢物莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜。

3 结 论

本研究建立高效液相色谱-串联质谱测定乳制品中的莫奈太尔及其代谢物莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的方法。结果表明，各组分的加标回收率为79.5%～102.9%之间，相对标准偏差为2.0%～5.3%。该方法操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强，测定结果准确可靠、成本低，应用于牛乳和乳粉等乳制品中莫奈太尔及其代谢物的检测，可以得到满意的结果。