李树华 邓伟 毛洪波 秦丽

中耳胆脂瘤是耳鼻咽喉科的常见病之一。胆脂瘤本质为炎症反应包裹的囊性物质[1],是由脱落坏死的复层鳞状上皮组织、纤维组织、角化物、胆固醇结晶等物质堆积形成。其主要临床体征为鼓膜穿孔以及对听骨链、乳突、颅骨等周围骨质的渐进性、侵蚀性、溶骨性的破坏,导致听力下降及颅内外严重并发症[2]。文献报道，胆脂瘤的溶骨作用主要是由于胆脂瘤上皮、肉芽组织等释放的蛋白水解酶对细胞外基质的降解所致[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一组重要的降解酶家族,主要作用机制为通过降解组织细胞外基质(extracellular matrixc，ECM),破坏正常的组织形态,促进肿瘤细胞的浸润、转移等发展过程[4]。研究表明,MMP-13和MMP-9在多种肿瘤细胞中呈现高表达状态,对肿瘤细胞的浸润等特性起到重要促进作用[5,6]。因此,本研究拟通过检测在中耳胆脂瘤中的MMP-13和MMP-9分布及表达水平,观察二者与骨质破坏程度的相互关系,进一步探讨中耳胆脂瘤对周围骨质破坏的可能机制。

资料与方法

1 一般资料

选取2013年6月～2017年8月我院耳鼻咽喉科收治的中耳胆脂瘤患者的手术标本，共176例，男女之比为 11∶7,年龄 6～65 岁,平均（37.5±18.3）岁。每例均获取中耳胆脂瘤上皮组织及正常的外耳道皮肤。所有标本均经有经验的两位病理科医师检查、证实。所有患者或家属均签署知情同意书。

2 试剂

鼠抗人MMP-9多克隆抗体,兔抗人MMP-13多克隆抗体,SP试剂盒等均购自上海越研生物科技有限公司。

3 评判标准

3.1 MMP-13和MMP-9的分布及表达水平判定

阳性细胞判定：细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒。采用多媒体彩色免疫组化病理图像分析系统对染色结果进行定量分析,同时对阳性细胞表达的平均光密度（IOD）作定量分析。

3.2 中耳胆脂瘤侵袭能力评定[7]

根据术中所见评定中耳胆脂瘤上皮组织对听骨链的破坏及周围骨质的侵犯范围：无明显听小骨破坏为 (+),破坏砧骨为 (++),破坏砧骨和锤骨为(+++),破坏砧骨、锤骨、乳突天盖和/或乙状窦骨板为(++++)。

4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件包进行分析、处理。平均光密度值采用均数±标准差(x¯±s)表示,分析采用t检验及Spearman相关性分析,检验水准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MMP-13和MMP-9在中耳胆脂瘤组织及正常外耳道皮肤中的表达

MMP-13和MMP-9蛋白在中耳胆脂瘤组织及正常外耳道皮肤的各层细胞中均有不同程度的表达,主要位于细胞质内。在中耳胆脂瘤上皮组织内的表达呈中等至强阳性,以基底层表达最强；而在正常外耳道皮肤组织中表达呈弱阳性或阴性（图a、b、c、d）。

2 MMP-13和MMP-9在胆脂瘤上皮组织和正常皮肤组织阳性例数的IOD及相关性分析

MMP-13蛋白在两组阳性例数的IOD分别为0.261±0.031 和 0.249±0.023（P＜0.01）,MMP-9 蛋白在两组阳性例数的IOD分别为0.252±0.021和0.235±0.015（P＜0.05）。经 Spearman 相关分析,二者表达存在正相关（r=0.653,P＜0.01）,见表 1。

表1 MMP-13和MMP-9在胆脂瘤上皮组织和正常皮肤组织阳性例数的IOD

3 MMP-13和MMP-9阳性表达与胆脂瘤侵袭能力的关系

通过Spearman相关分析MMP-13和MMP-9的IOD显示：胆脂瘤骨质破坏程度与胆脂瘤上皮组织中MMP-13和MMP-9均呈正相关性（r分别为：0.657、0.589；P＜0.01）。MMP-13 和 MMP-9 表达的IOD越大,胆脂瘤骨质破坏程度就越强,见表2。

表2 MMP-13和MMP-9的IOD与中耳胆脂瘤骨质破坏程度的关系

讨论

近年来,中耳胆脂瘤对骨质破坏机制的研究越来越引起了国内外学者的关注,但仍对骨质破坏的发生、发展等作用机制尚不明确。胆脂瘤是由囊内容物、上皮组织、细胞外基质等物质共同构成,其本质并非传统意义上的肿瘤,但它却具有肿瘤的某些生物学特性。研究结果表明,胆脂瘤上皮组织的过度增殖可能与上皮组织下血管周围基质降解有关,它具有促进微血管增生的能力[8],这也可能是胆脂瘤组织对破骨和溶骨机制发生、发展的重要因素之一[2]。

MMP-13与MMP-9是基质金属蛋白酶家族（MMPs）中重要的成员。MMP-13又称胶原酶-13，在MMPs瀑布式的活化级联反应进程中起着调节、枢纽的作用，即它不仅受到多种MMPs因子的调节,活化后共同参与ECM的降解过程，还能活化MMP-2和MMP-9等因子促进肿瘤细胞的侵袭、转移等作用[9,10]。MMP-9是一种明胶酶，活化后成为Ⅳ型胶原酶。而Ⅳ型胶原酶存在于ECM中。因此,活化后MMP-9可以直接降解ECM，促进生理性和病理性溶骨的发生、发展过程[11]。文献报道,MMPs导致软骨退行性改变的发生、发展过程的结论已经被广泛认可,MMP-13与MMP-9在软骨细胞外基质的降解过程中具有重要作用[12]。本文目的旨在,研究MMP-13与MMP-9在中耳胆脂瘤的表达以及与周围骨质破坏的关系,分析其相互租用机制。现将实验结果做如下分析：

本实验中,发现MMP-13与MMP-9蛋白表达主要定位于胞质中,与文献报道一致。通过对表达蛋白进行平均光密度值的检测,可以看到两者在胆脂瘤上皮细胞的胞质呈现高表达,而在正常外耳道皮肤组织中呈现低表达或不表达,经过对两者蛋白IOD值的Spearman相关分析,说明MMP-13与MMP-9应该与胆脂瘤的发生、发展相关,且两者存在正相关性。实验中还发现,当降低MMP-13抗体浓度时,MMP-9蛋白表达IOD值亦会降低,反之依然。说明胆脂瘤在发生、发展过程中应该受到MMP-13对MMP-9的调节作用。

通过研究MMP-13和MMP-9阳性表达与胆脂瘤侵袭能力关系,我们可以看到胆脂瘤患者以+++级为主,即砧骨和锤骨的破坏。通过查阅文献[2,3],本文结论与文献报道相符。通过分析说明,中耳胆脂瘤上皮组织中MMP-13和MMP-9表达对周围骨质的破坏有密切相关性。其侵袭机制,可能是MMP-13作为中心调节枢纽,活化、启动下一级密码MMP-9形成Ⅳ型胶原酶,降解ECM中的Ⅳ型胶原酶和促进微血管增生，导致胆脂瘤上皮的过度增值,直接参与骨质的破骨、溶骨等进程。

本研究,从理论上进一步阐明了MMP-13和MMP-9与中耳胆脂瘤的相关性,为该疾病的发生、发展、侵袭机制等提供了理论参考依据。由于该疾病发病机制尚不明确,且具有复杂性和多样性等特点,给临床诊疗工作带来了诸多挑战。胆脂瘤发生、发展等过程的的机制仍然是目前该领域研究的热点,需要国内外学者进一步探讨和研究。