肖盛中，马振国，李 岩，马旭升，李 爽，杨若松，盛金良*

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.北京维德维康生物技术有限责任公司，北京 100095)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，为单链正股 RNA 病毒，是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的代表种，该病毒引起的牛病毒性腹泻—粘膜病发病率高，致死率低，病牛常出现发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽等主要症状，怀孕母牛流产或产出畸形胎儿。目前我国BVDV 感染比较普遍，尤其规模化牛场抗体检出率是散养牛场抗体检出率的6 倍多[1]。BVDV 感染怀孕母畜后造成胎儿免疫耐受进而发展为持续性感染(PI)，PI 胎儿出生后即为 PI 牛。PI 牛常年带毒排毒，是牛群中BVDV 感染的主要传播来源。近年对新疆地区BVDV 抗体和抗原的检测及流行病学调查表明BVDV 感染已在新疆广泛存在，并且根据BVDV 5'-UTR 的高突变性已有研究显示在新疆存在不同基因型的BVDV[2-3]。

Erns(E0 或gp48)是组成病毒的囊膜糖蛋白之一，含有8 个可糖基化位点，去糖基化分子量约27 ku，可以与细胞表面黏多糖特异性结合，且与被感染细胞的可溶性病毒颗粒分泌相关[4]。此外Erns为瘟病毒属特有，具有 RNase 活性，对单链和双链 RNA 的降解具有促进作用，在感染细胞的RNA 合成调控中有着重要影响，可在病毒感染初期削弱宿主的免疫防御[5]。无论是控制BVDV 感染的抗病毒药物研发方面，还是抗体检测方面，Erns蛋白均具有重要意义[6]。本实验通过对新疆地区BVDV 流行株的基因序列分析及Erns结构蛋白抗原优势表位的预测，利用大肠杆菌表达了重组蛋白Erns，建立基于Erns蛋白的 BVDV 间接 ELISA 方法，对新疆地区 BVDV 血清抗体检测和血清流行病学调查具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 肛拭子样品与被检血清均采集于新疆石河子、沙湾和克拉玛依地区某规模化牛场腹泻病牛，BVDV 阳性血清(经美国IDEXX 公司抗体诊断试剂盒检测为阳性)和BVDV 阴性血清也均来自以上牛场；牛布鲁氏菌(BR)、牛口蹄疫(FMD)、牛支原体(MB)、牛副结核(Map)及牛传染性鼻气管炎(IBR)阳性血清由石河子大学人畜共患病实验室保存。

总RNA 提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；RT-PCR 试剂盒购自Promega 公司；限制性内切酶NdeⅠ与HindⅢ、DNA Marker、T4 DNA 连接酶等均购自宝生物工程(大连)有限公司；蛋白Marker 购自 TRAN 公司；质粒 DNA 纯化试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；BVDV 抗体检测试剂盒购自美国 IDEXX 公司(D341)；96 微孔板购自 Thermo 公司；辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG(IgG-HRP)购自美国Jackson ImmunoResearch 公司。

1.2 引物的设计与合成 根据本实验室获得的BVDV 全长基因序列，合成扩增Erns部分抗原表位基因引物，序列如下：P1：5'-CCCATATGGAGAAC ATCACACAATGGAATC-3'/P2：5'-CCCAAGCTTTG CGTACGCCCCGAACCAT (下划线分别为NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点)，预期扩增目的片段为 681 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。

1.3 BVDV-Erns基因的PCR 扩增及重组表达载体pET-30a-Erns的构建 参照RNA 抽提试剂盒操作说明抽提肛拭子样本总 RNA，反转录为 cDNA，以cDNA为模板，P1/P2为引物PCR扩增 BVDV-Erns基因。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、53 ℃30 s、72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃10 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，克隆至 pMD18-T 载体，构建重组载体 pMD-18T-Erns。将pMD-18T-Erns经NdeⅠ、HindⅢ双酶切，回收目的片段克隆于经同样酶切处理的pET-30a 中，构建重组质 粒 pET-30a-Erns。将 pET-30a-Erns转化BL21感受态细胞，涂于含卡那霉素的培养基板上37 ℃过夜培养，选取生长良好的阳性菌落进行菌液PCR 与测序鉴定。

1.4 重组蛋白的表达及抗原性鉴定 阳性菌培养至OD450nm值达对数生长期时加入终浓度为1 mmol/mL的 IPTG 诱导 6 h，经 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达情况。表达后的重组蛋白利用亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化；以 BVDV 阳性血清(1:50)为一抗，以兔抗牛IgG-HRP为二抗(1∶8 000)，western blot 检 测重组蛋白的反应原性。

1.5 ELISA 方法的的建立 采用方阵法确定抗原最佳包被浓度(0.0125 μg/ 孔 、0.025 μg/ 孔、0.05 μg/孔、0.1 μg/ 孔、0.2 μg/ 孔和 0.4 μg/ 孔)、阴 / 阳性血清最佳稀释度( 1∶25、1∶50、1∶100 和 1∶200)、兔抗 牛 IgG-HRP最佳稀释度(1∶5 000、1 ∶10 000 和1∶20 000)、封闭液及其浓度(1 %酪蛋白、5 %脱脂乳、1 % BSA、0.1 %海藻糖、0.5 %明胶、1 %马血清、3 %马血清和5 %马血清)、阴/ 阳性血清最佳稀释液(PBS、1 %马血清，3 %马血清和5 %马血清)、兔抗牛 IgG-HRP 反应时间与反应温度均为30 min、37 ℃，底物显色时间 10 min。选择 P/N 值(阳性样本 OD450nm值 / 阴性样本 OD450nm值)最大的孔对应的反应条件，为最佳条件。

1.6 临界值的确定 利用建立的间接ELISA 方法对 46份健康牛血清进行检测，计算 S/P 值(样本OD450nm值 / 阳性对照 OD450nm值)，及 S/P 的平均值 和标准差 SD，当被检样本 S/P 值≥+2SD 时判为阳性，S/P 值时判为阴性。

1.7 特异性试验 利用优化的间接ELISA 方法对BVDV 阴阳性血清、BR、牛 FMD、牛 MB、Map 和IBR 阳性血清同时进行检测，根据S/P 值判断反应结果，评价本试验建立方法的特异性。

1.8 敏感性试验 将1份 BVDV 阳性血清进行 2倍倍比稀释(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400)，利用优化后的间接 ELISA 方法进行检测，计算能够检出阳性血清的最高稀释度。

1.9 重复性试验 利用建立的ELISA 方法对已知的8份不同效价血清，每份血清做 3组重复，进行批内重复性试验；选择5 块不同包被时间的ELISA板，对上述 8份血清样本，每份做 3组重复，进行批间重复性试验。

1.10 与商品化试剂盒的比较试验 利用所建立的间接 ELISA 方法和美国 IDEXX 公司的 BVDV ELISA 抗体结果并检测试剂盒同时检测156份临床牛血清样本，比较检测结果并计算二者符合率。

同时利用本实验室建立的方法对新疆石河子、沙湾、塔城等地区5 个未接种BVDV 疫苗的牛场采集的564份牛血清样品进行BVDV 抗体检测，计算其阳性率。

2 结 果

2.1 BVDV-Erns基因的RT-PCR 扩增 以牛肛拭子样品中反转录得到的总cDNA 为模板，PCR 扩增Erns基因，结果显示在约 700 bp 出现目的条带，与预期相符(图1A)。表明 PCR 扩增得到 Erns基因。

2.2 重组表达载体pET-30a-Erns的鉴定 重组质粒 pET-30a-Erns经NdeⅠ/Hind Ⅲ酶切鉴定显示，得到约700 bp 的片段和约4 900 bp 的质粒片段，与预期结果一致(图1B)。测序结果与目的序列符合，表明正确构建了重组质粒pET-30a-Erns。

图1 Erns 基因PCR 扩增结果与表达重组质粒的鉴定Fig.1 Amplification of Erns gene by PCR and identification of the pET-30a-Erns by restriction enzyme digestions

2.3 Erns重组蛋白的表达与鉴定 重组菌经IPTG诱导 6 h 后，SDS-PAGE 结果显示，表达的重组蛋白相对分子质量约为26 ku，与理论分析值相符合(图2A)。表明目的蛋白正确表达。Western blot 结果显示通过原核表达的Erns重组蛋白能够被BVDV 阳性血清中的特异性抗体所识别(图2B)，表明该蛋白具有良好的反应原性，可以作为ELISA 检测抗原。

图2 Erns 重组蛋白表达的检测(A)与鉴定(B)Fig.2 The detection (A) and identification (B)of the rErns expression

2.4 间接ELISA 检测方法反应条件优化结果 根据方阵滴定试验对间接ELISA 各反应条件进行优化，确定最优反应条件见表1。

2.5 临界值的确定 46份阴性血清的S/P 平均值为0.060±0.030，经 SPSS Kolmogorov-Smirnova 检验分析，呈正态分布(图3)。根据统计学原理，阳性临界值+2SD 为 0.12，即当待检样本 S/P 值≥0.12 时判定为阳性，S/P 值＜0.12 时判定阴性。

2.6 特异性试验 采用建立的间接ELISA 检测方法对 BR、FMD、MB、Map、IBR、BVDV 的阳性血清及BVDV 阴性血清进行检测。结果显示仅BVDV阳性血清 S/P 值≥0.12，为阳性，其余均为阴性(表2)。Erns抗原与以上病毒、细菌及支原体的阳性血清无交叉反应。表明该方法具有较强的特异性。

表1 间接ELISA 检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized conditions of the indirect-ELISA

图3 阴性样品正态分布图Fig.3 The normal distribution of negative serum samples

表2 特异性试验结果Table 2 The specificity test of the indirect ELISA

2.7 敏感性试验 采用建立的间接ELISA 检测方法对不同稀释度的阳性血清进行检测，结果显示当阳性血清稀释到1∶1 600 时，二抗1∶10 000稀释 ，S/P 判定值仍然高于临界值0.12 (表3)，表明该方法的敏感性较高。

2.8 重复性试验 将8份不同血清样品分别进行批内和批间重复性试验，统计学分析结果显示其变异系数分别为3.66 %～9.89 %和1.23 %～9.47 %，变异范围均小于10 % (表4)。表明建立的ELISA 检测方法具有良好的重复性。

2.9 临床样品检测结果 利用所建立的间接ELISA检测方法和美国IDEXX 公司的BVDV ELISA 抗体检测试剂盒同时检测150份临床牛血清样本，结果显示两者的阳性符合率为86.45 %，阴性符合率为91.04 %，总符合率为 88.67 % (表5)。表明所建立的间接ELISA 检测方法与IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率较高，检测结果比较可靠。

表3 敏感性试验结果Table 3 The sensitivity test of the indirect ELISA

表4 间接ELISA 重复性试验(n=8)Table 4 The repetition tests of the indirect ELISA (n=8)

表5 血清样品的间接ELISA 与IDEXX 试剂盒检测方法比较Table 5 The comparison of serum detection by indirect ELISA and IDEXX kit

利用本实验建立的间接ELISA 对采集的564份血清样本进行检测。结果显示5 个牛场抗体阳性率分别为：11.76 %、13.04 %、82.76 %、77.96 %、75.82 % (表6)，表明新疆部分地区规模化牛场BVDV 抗体阳性率较高。

表6 5 个牛场临床样品检测结果Table 6 The detection of clinical samples from 5 cattle farms

3 讨论

BVDV 临床发病率高，症状复杂，可跨物种传播，给整个畜牧行业带来严重安全隐患[7]。同时BVDV 不仅降低青年牛的生产能力，也对牛血清、冻精、冷冻胚胎和细胞等“ 牛源”生物制品质量安全存在着严重的威胁[8]。其中PI 牛作为主要传染源，更是牛制品行业的隐形杀手。所以PI 动物的诊断清除，是BVDV 防控中的重中之重，也是净化控制中的基本要素。间接ELISA 是血清学检测方法中具有较高敏感性和特异性的检测方法之一，检测结果较为准确客观。

目前，瑞典等发达国家主要使用间接免疫过氧化物酶(IPX)对 PI 动物进行检测。有学者对220份牛血清分别使用 IPX 和 Erns-ELISA 进行检测，两种检测方法均能够很好的检出阳性样本，并且大部分样本的校正光密度(COD，COD= 样本 OD450nm- 阴性对照OD450nm)值之间具有良好的分离性。其中只有一个阳性样本，通过IPX 检测 COD 值接近临界值。由此推测，PI 动物中病毒滴度主要在102.2TCID50/mL～106TCID50/mL，而感染初期病毒滴度主要维持在100.9TCID50/mL，则判断该样本属于感染初期病牛，体内病毒滴度较低，从而证明ELISA 检测方法灵敏度要高于 IPX 检测[9]。另一方面，虽然 PI 动物体内的病毒滴度普遍较高，但存在个别PI 动物病毒滴度低于理论值范围。因此，该血清样品也可能来源于PI 动物，但病毒滴度较低，接近ELISA 检测极限，而IPX 检测则难以区分。此外也有研究表明，两种检测方法会受到PI 小牛体内母源抗体的干扰。有研究分别对4份存在母源抗体的PI 小牛血清进行IPX和ELISA 检测，结果表明ELISA 受被动免疫干扰较少[10]。此外，有实验证明 ELISA 的性能不受血清热失活影响，即使运输过程中经历高温，或实验室常规热灭活，仍能够良好检出。

起初诊断性ELISA 试剂盒需要病毒侵染细胞后，提取细胞培养物作为ELISA 检测抗原，成本昂贵，灵敏度低，特异性差。近年来 ELISA 检测主要使用重组蛋白包被，通过原核或真核表达出具有抗原性的重组蛋白，显著降低经济成本，也显示出较高的灵敏度和特异性。且使用原核表达成本更低，表达量更多。目前已有国外学者使用Erns蛋白包被，一抗孵育条件 37 min 2 h，对 BVDV 进行检测，具有良好检测效果[11-12]。此外，国内也有学者使用BVDV 灭活浓缩后作为ELISA 包被抗原，一抗孵育条件 37 min 1 h，检测 BVDV 特异性抗体，成本高反应时间长[13]。与其相比，本研究利用原核表达技术表达重组Erns蛋白作为抗原，成本低表达量高；通过对封闭液、样本稀释液及稀释倍数3 个影响因素的调节，使一抗、二抗的孵育时间均为30 min，可大大缩短检测时间，提高检测效率；此外根据对酶标二抗浓度的调节，1∶10 000 酶标二抗的使用量，即可降低检测成本，还降低了阴性样本OD450nm值，使其普遍低于0.2，阳性样本COD 值分离性良好，阴/ 阳性样本显色差异显著。因此，该 ELISA 检测法操作简单、成本低，更适用于规模化的生产和大批量样本的检测。

新疆作为我国畜牧大省，已有研究发现有不同基因型BVDV 的存在。本研究通过对新疆石河子、沙湾、塔城等地区5 个牛场(其中2 个为散户牛场，3 个为规模化牛场)的564份牛血清样本利用建立的方法进行抗体检测，结果表明以上地区规模化牛场BVDV 感染较为严重，并且规模化牛场抗体阳性率是散户牛场6 倍之多，与报道相符[1]，能够较好的检测出该地区BVDV 抗体。

本研究建立的基于Erns抗原的BVDV 间接ELISA 检测方法为我国养牛业的BVDV 的血清流行病学调查和养牛业的健康发展奠定了良好的基础。