李俊玉，雍艳红，方 彪，于天月，吴莲云，巨向红,3*

(1.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108；2.广东海洋大学 动物医学系，广东 湛江 524088；3.广东海洋大学 动物科学系，广东 湛江 524088)

热应激是指处于极端高温环境中的动物机体，表现出的热喘息、免疫力下降、心力衰竭、代谢加快等非特异性生理反应的总和。而热应激也已经成为我国南方地区应激性致病因素中危害最大的一种，给养殖业造成了重大的经济损失[1]。热应激猪出现生长缓慢、免疫力下降及对疫病的敏感性增高等现象[2]。本研究前期研究显示，热应激能够显著上调猪 Toll 样受体家族中的 TLR2、TLR4 和 TLR4选择性剪切体的表达[3]，炎性因子 IL-2、IL-12 和IFN-γ 的表达也发生改变，出现严重的炎性因子紊乱[4]，从而激活机体的免疫系统。

核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain-containing protein，NOD)样受体家族(NOD-like receptors，NLRs)属胞浆内模式识别受体家族[5]，参与信号传导的调控，在免疫应答过程中发挥重要作用。目前确定的哺乳动物NLRs 有 23 种，其中 NOD1 和 NOD2 是 NLRC 亚型中最重要的 2 种胞浆受体。研究表明，NOD1/2 与配体结合后，其构象发生变化，与下游受体作用蛋白 2 (Receptor- interacting protein 2，RIP2)相互作用使 IκB 磷酸化，从而激活核转录因子 NF-κB，介导炎症介质的表达[6]。NOD 还能够作用于半胱天冬酶，介导细胞凋亡或相关细胞因子的表达[7]。

作为胞浆内模式识别受体家族的重要成员，NOD1/2 在各种病原体的感染和固有免疫过程中均起着重要的作用，是近几年免疫学研究的热点。Sengar 等研究显示，在体外急性热应激牛外周血单核细胞(PBMC)和MDBK 细胞模型中检测到NOD1/2表达上调[8]。因此，深入探究热应激条件下NOD 样受体与炎性因子的表达规律，将有助于阐述其在热应激致病中的作用机制。鉴于此，本研究检测了热应激不同时段猪 PBMC 中 NOD1、NOD2 及部分炎性因子的转录水平变化，为系统阐述NOD 样受体在热应激致病中的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12 头 2月龄(体重为 15±1 kg)的土杂猪(雷州黑猪♀×杜洛克♂)饲养于广东海洋大学农学院实验动物中心。适应两周后，实验猪被随机分为两组，对照组和热应激组。对照组常规饲养，环境温度为 20±2 ℃，相对湿度 80 %～85 %。热应激组饲养于环境温度为35±1℃的人工气候温室，相对湿度80 %～85 %。以全价饲料(大北农农牧科技有限公司，小猪料)饲喂，每日早、中、晚各一次，自由饮水。分别在热应激的第 0、7 d、14 d 和 21 d 采集猪外周血备用。

1.2 主要试剂 猪淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)、TB GreenTMPremix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (RR820A)、DL2000 DNA Marker (3427A)、SYBR Green I荧光定量PCR检测试剂盒均购自TaKaRa 公司；核酸染料购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂粉购自Sigma 公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank 中登录的猪 NOD1/2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β、内参基因 GAPDH 的序列，利用 Premier 5.0 软件设计扩增引物(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列及产物长度Table 1 Primer sequence and product size

1.4 实验猪PBMC 总RNA 的提取及反转录 分别于热应激的第 0、7 d、14 d 和 21 d，经前腔静脉采集实验猪外周抗凝血，按照猪外周血淋巴细胞分离试剂盒说明书分离其PBMCs。TRIzol 法提取PBMC的总RNA 后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，酶标仪检测 OD260nm/OD280nm比值，大于 1.8～2.0 的样品冻存于-80 ℃冰箱备用。同时将其反转录为cDNA，保存在 -20 ℃冰箱。

1.5 实验猪PBMC 荧光定量PCR(qPCR)的检测按照 SYBR Green I qPCR 检测试剂盒说明书，以PBMCs 反转录后的cDNA 为模板，以表1 中的各对引物，qPCR检测NOD1、NOD2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 和 IL-1β mRNA 的转录水平。反应条件为：95 ℃ 35 s；95 ℃ 20 s、58 ℃35 s、72 ℃ 20 s、共 40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min；95 ℃ 15 s，温度每升高 0.2 ℃采集荧光一次。

1.6 数据分析 采用相对定量，通过计算 2-ΔΔCt值求出目标基因在PBMC 中的相对转录水平，ΔΔCt=(目的基因 Ct - 管家基因 Ct)试验组-(目的基因 Ct - 管家基因Ct)对照组，将对照组中不同时间点PBMC 所得数据进行归一化处理，处理组以对照组的倍数表示作图。采用SPSS 20.0 软件进行显著性分析，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01 表示差异极显著。多重线性回归分析 NOD1/2 与 TNF-α、IFN-γ 等 6 种细胞炎性因子之间的相关性。

2 结 果

2.1 q PCR 方法的建立 采用SYBR Green I qPCR法检测各目标基因的转录水平，对目标基因的扩增曲线、熔解曲线观察发现，热应激不同时段猪PBMC各目标基因的扩增曲线均为标准的“ S”形(图1)，且间距均匀。熔解曲线均为特异的单峰(图2)，且起峰时间一致，表明引物特异性较好，产物纯度高，没有受到污染，定量结果相对稳定，结果可信。

图1 目的基因qPCR的扩增曲线Fig.1 Amplification curves of target genes detected by qPCR

图2 目的基因qPCR的熔解曲线Fig.2 Melting curves of target genes detected by qPCR

2.2 热应激猪 PBMC 中 NOD 样受体 mRNA 转录水平的变化 与对照组相比，应激组实验猪PBMC中NOD1 和NOD2 mRNA 转录水平在热应激处理的第7d显著上调(p＜0.05)，在第14d极显著上调(p＜0.01)，但在热应激处理的第21d显著下调(p＜0.05) (图3)。表明在热应激处理过程中 NOD 样受体mRNA 的转录水平发生了显著的变化，推测其可能参与了猪的热应激调节过程。

图3 热应激猪外周血淋巴细胞中NOD1/2mRNA转录水平的检测结果Fig.3 The mRNA transcriptional level of NOD1/2 in PBMCs of heat-stress pigs

2.3 热应激猪PBMC 中炎性因子mRNA 转录水平的变化热应激条件下，猪PBMC 中 TNF-α 和IFN-γ mRNA 转录水平在热应激第 7 d、14 d 和 21 d极显著上调(p＜0.01)。IL-10 mRNA 的转录水平在热应激第7 d 较对照组猪降低，但在第14 d 和第21 d极显著上调(p＜0.01)。IL-1β mRNA 的转录水平在热应激的第 7 d 和第 14 d 极显著上调(p＜0.01)，但在第 21 d 时该转录水平极显著下调(p＜0.01)。IL-6 mRNA 转录水平在热应激的第7 d 显著上调(p＜0.05)，但在第21d该转录水平极显著下调(p＜0.01) (图4)。可见热应激引起了 PBMC 中炎性因子的显著变化。

图4 热应激猪外周血淋巴细胞中炎性因子mRNA转录水平的检测结果Fig.4 The mRNA transcriptional levels of inflammatory cytokines in PBMCs of heat-stress pigs

2.4 PBMC 中NOD1/2 与炎性因子的相关性分析热应激猪PBMC 中NOD1/2 mRNA 水平与相关炎性因子多重线性回归分析显示，与对照组相比，应激组实验猪 PBMC 中 NOD1 与炎性因子 IFN-γ 和 IL-10之间相关系数较高，分别为0.991、0.899, NOD2 与炎性因子IFN-γ 和IL-10 相关性也较高，相关系数分别为 0.991 和 0.932。由此表明 NOD1/2 的上调均与炎性因子IFN-γ 和IL-10 存在正相关。

3 讨 论

应激与免疫之间的关系是通过神经内分泌系统联系在一起的。应激引起下丘脑 - 垂体 - 肾上腺(HPA)轴反应, 导致各种激素(例如 CRH、GC、ACTH 等)分泌亢进[9]，而这些激素又作用于各种细胞因子，从而使得应激与机体的免疫功能紧密联系在一起。由于高温的作用，热应激比普通的应激更为复杂。

NODs 作为固有免疫的胞质受体，能够识别病原体病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，在宿主防御病原体的过程中起关键作用。NOD1/2 与相应的配体识别后可以激活下游信号通路，如NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPK)信号，导致促炎因子分泌，并通过级联反应放大炎症反应，最后清除病原菌。Yan 等研究显示，热应激通过激活capase-1 和NOD 样受体家族组成的炎性小体最终造成小鼠肝损伤[10]。本研究通过qPCR 检测显示，在热应激的前期，NOD1 和NOD2 mRNA 转录水平显著上调，这表明NOD 样受体转录水平的升高是热应激对机体免疫系统早期的主要反应。但诱导NOD上调的分子机制还需进一步研究。

炎症反应是机体对外来刺激产生的一种病理性反应过程。一些细胞因子能够显著促进炎症反应的发生，如IL-1、IL-6 和 IL-8 等可以直接刺激中枢系统引起体温升高，促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放[11]。胡艳欣等研究显示热应激处理第1 d 和 3 d 时猪血清中 IL-2 水平显著上升，TNF-α 水平也随之上升[12]。研究显示热应激状态下，小鼠血液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 等炎性因子的含量会急剧升高，最终导致机体多器官功能损伤[10,13]。本研究显 示 猪 PBMCs 中 TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、IFN-γ 等 mRNA 转录水平在热应激的第 7 d 和 14 d显著上调，推测热应激诱发了机体的炎性过程。

NOD 样受体是机体重要的胞内识别受体，在热应激条件下显著升高。相关性分析显示，其与炎性因子 IFN-γ 和 IL-10 的变化呈正相关。推测热应激条件下 NOD 被激活，经一系列的级联反应，激活了NF-κB 或MAPK 信号通路，介导了炎性因子的上调。但有关热应激条件下NOD 受体与炎性因子调控的确切机制还需进一步的研究。