曾祺，张志国

(齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，济南250353)

0 引 言

凝乳酶（MCE）通常专用于指代能够诱导牛奶凝乳形成的功能性酶制剂，现凝乳酶的来源主要有四种：动物性来源、植物性来源、微生物来源及通过生物工程改造的微生物发酵所得[1]。乳制品行业日益增长的需求使得传统凝乳酶（动物性来源）无法满足市场需要，20世纪60年代初开始，在世界范围内人们就已经开始寻找动物性凝乳酶的替代物；而微生物凝乳酶（MCEs）良好的功能特性及低廉的生产成本使其成为传统凝乳酶的重要替代品之一，有资料显示，到目前为止，微生物凝乳酶已用于全球三分之一奶酪的生产中。

传统的动物性凝乳酶（小牛皱胃凝乳酶）的凝乳酶最初是以凝乳酶原存在，其分子量为40777 u，由365个氨基酸组成[2]。在酸性条件下，不具有凝乳活性的非活性凝乳酶自水解可生成两种活性蛋白[3]：在pH4.2时，自水解剪切N末端的42个氨基酸，形成分子量为35 622 u(323个氨基酸)有活性的凝乳酶（chymosin）；以及在pH2.0时，自水解剪切N末端的27个氨基酸，形成生成分子量为37 400（337个氨基酸）组成的假凝乳酶（pseudochymosin），后者在pH为4.5时可转化为凝乳酶（chymosin）。

凝乳酶蛋白结构具有酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的结构特点，主要是由氨基酸残基和水分子在活性位点形成广泛的氢键网状结构以维持的，与其他真核细胞天冬氨酸蛋白酶有高度的同源性。凝乳酶由1-175氨基酸残基的N端与176-323的C端组成，深沟状活性区域位于N、C端区域分界，两个天冬氨基酸活性位点：Asp-34和Asp-216位于深沟状活性区域底部[4]。其高级结构以β片层结构为主，与其他折叠方式一起形成了凝乳酶蛋白的肾状结构。大量的分子间及分子内氢键、二硫键维持了凝乳酶蛋白结构及催化性能的稳定；其中，二硫键Cys-250和Cys-283的变化（羧基化或汞化）会直接影响凝乳酶的催化活性。由于两个等位基因的不同表达，凝乳酶根据第244位氨基酸残基的不同又分为凝乳酶A（残基为Asp）和凝乳酶B（残基为Gly），相较而言，凝乳酶A由于244位上的Asp具有强电子活性[5]从而具有比凝乳酶B更高的对κ-酪蛋白的催化活性，但同时，凝乳酶A的稳定性比凝乳酶B低。

微生物是凝乳酶的良好来源，产生的凝乳酶的凝乳过程与动物性凝乳酶类似：在适当的外部条件（适当的温度、pH、离子浓度等）下，特异性水解κ-酪蛋白的特殊肽键，从而使其亲水C端部分的酪蛋白巨肽释放到乳清中，κ-酪蛋白天然结构的改变使分子间斥力丧失，酪蛋白胶束聚集并开始形成三维凝乳网络[6]。据报道：现已有40余种微生物可产生凝乳酶；超过100种真菌通过各种生物技术手段作为生产凝乳酶的既定来源[7]；在已有的对微生物来源的凝乳酶研究中，大部分微生物凝乳酶（MCEs）表现出比动物性凝乳酶高的催化活性及稳定性[8]，这些特性在乳品行业中具有重要的意义。

1 产凝乳酶的微生物概述

1.1 天然产凝乳酶微生物

现阶段，微生物凝乳酶（MCEs）的来源主要是放线菌、细菌、真菌等[9]，如：米曲霉（Aspergillus-oryzae）、栗疫菌（Endothia parasitica）、米黑毛霉（Mucor miehei）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[10-12]等。微生物凝乳酶本质上属于蛋白质水解酶，根据其催化类型的不同分属天冬氨酸蛋白酶（Aspartic proteases）[13]，金属蛋白酶（Metallo proteases）[14]，丝氨酸蛋白酶（Serine proteases）[15]等蛋白酶种类；微生物蛋白酶的巨大多样性，使其在满足不同食品工艺要求方面具有得天独厚的优势。

1.2 生物工程技术改造的产凝乳酶微生物

1.2.1DNA重组（rDNA）技术

早在90年代，重组小牛凝乳酶已经由美国食品及药品监督管理局（FDA）登记注册，成为第一种由DNA重组技术制造的食品添加剂[22]。通过分析确定的控制凝乳酶产生的基因序列，将其导入至产酶性能优良的GRAS微生物中[23]，这种利用特定基因在常用工业菌株中的异源表达已经成为获取微生物凝乳酶的重要手段。

Lucía Feijoo-Siota[24]等将蓬子菜（Galium verum）中控制凝乳酶合成基因导入到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中成功使其表达，并激活产生的凝乳酶使其具凝乳功能；Nan Wang[25]等人利用转基因技术将骆驼凝乳酶基因导入至巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中，并使转基因菌株表达了完整的骆驼凝乳酶原基因，重组凝乳酶表现出高凝乳活性及良好的热稳定性。

尽管利用DNA重组技术可显著降低凝乳酶的生产成本，但也有一定的局限性，由于改变的仅是工程菌种中的一小部分基因，得到的重组工程菌种中产凝乳酶基因的表达及凝乳酶性状有一定程度的不确定性，因此不一定能得到理想的凝乳酶。

1.2.2 基因非定向诱变

基因非定向诱变是指利用人工手段诱使微生物遗传物质改变，从而使其性状发生改变。利用UV辐射或化学诱变剂的诱变可快速选育出性状组合优良的诱变体；也可人工干预微生物DNA复制转录等途径得到理想的突变体。

Elizabeth A.Bodie[26]等人利用无性重组技术，经过诱变、筛选后得到了比亲本菌株高产15%凝乳酶的菌株，并确定了整合的凝乳酶DNA序列在染色体上的位置。王成忠[27]等利用复合(紫外和硫酸二乙酯)诱变处理出发菌株蓝色刺孢霉，选育出高产凝乳酶蓝色刺孢霉菌株；通过与小牛皱胃酶酶切位点比较,得出水解产物和小牛皱胃酶的基本相同。通常，突变容易引起蛋白质结构的变化，导致微生物原本的功能恶化。少数情况下，通过突变导致的DNA结构组分的改变会使微生物功能性状改善。而微生物性状的改变通常伴随着调节功能的丧失，但这种情况通常是必须的，例如：调节功能丧失导致酶产量增加。突变和选育主要是针对更高的整体生产力而非特定功能的突变，所以调节功能的丧失是很难避免的。

微生物繁殖转化快，结构简单，安全性高，易变异的特点使得微生物在食品酶制剂的生产中扮演十分重要的角色；微生物对外源基因的兼容性使得被导入的外源基因可在其体内进行表达，这些特性为微生物凝乳酶的生产应用提供了无限的可能。

2 微生物凝乳酶的生产

众所周知，微生物酶制剂的生产过程中，发酵是起决定作用的一个环节，发酵的目标是生产经济、安全、性能优良的酶产品；其过程由许多操作单元构成。对于MCEs的生产来说，最大的酶制剂得率仍然是最重要的影响因素；而最低的单位生产成本也是影响MCEs生产的重要的因素。优化每个操作单元并不一定能得到最佳的整体过程性能，尤其是当每个操作单元之间存在强烈的相互作用时[28]。因此，了解这些相互作用对凝乳酶生产的整体过程优化至关重要。

表1 不同微生物产生的凝乳酶的特性

生产微生物来源的凝乳酶的过程大体可分为两步：首先，选择培养基和培养条件以优化酶产量并增加凝乳酶的凝乳活性与其蛋白水解活性的比例（MCA/PA），选择合适的发酵方式（连续、分批、补料分批）进行深层液态发酵（SMF）或固态发酵（SSF）；随后，将所得粗酶进行纯化并被对酶进行修饰或改性以改善它们的功能性质，如:降低凝乳酶的蛋白水解活性，防止干酪苦味的产生；升高或降低凝乳酶的热稳定性以满足不同的使用需要等方面[29]。

2.1 产凝乳酶微生物的发酵

微生物水分活度高的过量游离水中发酵称为深层液态发酵（SMF）[30]，是典型的涉及产胞外酶微生物的发酵过程，相比于固态发酵（SSF），深层液态发酵（SMF）规模大，发酵过程参数易于控制，不存在传质及散热问题；并根据不同的生产需要有4种方式可选：分批培养，补料分批培养，灌注分批培养和连续培养。这些优势使其大规模运用于各类酶制剂的发酵生产。固态发酵中，微生物生长在较低水分含量及活度的环境中[31]，发酵过程较为粗放，对那些粗发酵产品可直接用作酶源的工艺而言，它具有特殊意义。相较于深层液态发酵（SMF），固态发酵（SSF）效价高，产物浓度较高，成本较为低廉。对于发酵类型的选择，需要结合实际的生产情况及微生物的特性，并经过试验确定。Chwen-Jen Shieh[32]等人同时利用固态及液态2种方式发酵来自纳豆中的4种凝乳酶产生菌种：枯草芽孢杆菌（纳豆）ATCC 7058，枯草芽孢杆菌（纳豆）ATCC 7059，枯草芽孢杆菌（纳豆）IFO 13169，枯草芽孢杆菌（纳豆）IFO 3335，对比了2种发酵方式下4种菌种产凝乳酶的活性、蛋白水解活性及热稳定性。

微生物培养基主要由碳源、氮源、无机盐、生长因子等组分构成，不同产凝乳酶的微生物对培养基组成成分，各组分含量及配比要求不同，为得到最优的发酵条件，必须经过大量的实验研究。

2.2 微生物凝乳酶的纯化

纯化过程的目标是在既定纯化条件下实现最高的回收率、最大的催化活性和最高的纯度。大多数食品工业用微生物凝乳酶为胞外酶，纯化的第一步即是从发酵液中分离细胞；对于细胞内酶，则需要通过机械或非机械方法破坏细胞，而后经过滤、离心、絮凝、浮选和最后的浓缩纯化制得[33]，所以，胞外酶对于工业应用而言更为理想，因为每个下游过程都更加经济。然而，纯化步骤的数量和经济可行性与所需纯度高度相关，这反过来又与酶的最终应用有关。

因此，在MCEs的生产中，最终的应用决定酶的纯化程度及步骤。特别是对于食品行业来说，纯化是至关重要的。所有MCEs的纯化步骤及其原理不尽相同，但也有即定的纯化流程和原则可循；高容量低价值的MCEs应该使纯化步骤的程度最小化，使其符合经济要求。

2.3 微生物凝乳酶的固定化及修饰

在实际生产应用中，任何微小的化学或物理因素引起的MCEs自然构象的永久或暂时变化都会影响其催化功能；因此常采用固定化及改性等手段提升MCEs的使用性，利用酶的固定化技术与酶的物理化学修饰可有效提升凝乳酶在乳制品制造中工艺条件下有限的稳定性以及纯酶制剂的利用率[34]。

Rajesh KumariNarwal等人[35]利用藻酸盐-果胶形成的高分子聚合物对从枯草芽孢杆菌MTCC10422纯化得到的凝乳酶进行包埋固定，固定化酶的产率达73%，并保留了大部分凝乳酶活力；经过固定化后的MCEs具有更广的PH使用范围及更高的热稳定性。

Hala RefaatWehaidy等人[36]将枯草芽孢杆菌KU710517产生的凝乳酶与4种活化的多糖结合，在所有的偶联物中，与聚乙二醇（PEG）结合的凝乳酶显示出最高的保留活性，为95.3%，研究表明：与PEG偶联的凝乳酶具有更高的催化效率与更高的热稳定性。

根据应用及酶本身的特性，MCEs的固定化及修饰方法不尽相同；但根据具体应用中的要求，评估固定化及改性后的酶的标准基本上保持不变，即单位质量中的高活性，高选择性（减少副反应），高稳定性（通过有效再利用降低成本），经济和创新性。

3 微生物凝乳酶的应用中存在的问题与对策

目前，微生物蛋白酶已占据了全球酶市场份额的65%，微生物凝乳酶更是占到了全球蛋白酶市场份额的33%。然而，在如此广阔的市场前景下，微生物凝乳酶的应用仍然受到许多条件的制约，如何打破这些制约微生生物凝乳酶发展的壁垒成为了现阶段微生物凝乳酶应用中亟待解决的问题。

3.1 苦味肽的产生及积累

具有良好催化效用的微生物凝乳酶需具备以下特征[37]：（1）在干酪加工过程中的pH与温度条件下保持较高的活力，形成的凝乳具有更加紧密和相互作用的结构。（2）具有较高的κ-酪蛋白水解活力(MCA)及较低的非特异性蛋白水解活力(PA)，通常情况下利用MCA/PA值来作为微生物凝乳酶的催化评价指标。（3）具有较高的热敏性，较低的热失活温度的微生物凝乳酶更加适用于干酪的生产。而微生物凝乳酶受自身特性的影响，通常具有较低的MCA/PA值与较高的热稳定性，这些特性导致了在微生物凝乳酶介导的凝乳过程中大量的苦味肽产生及积累。

现阶段的研究表明：苦味肽的产生主要来源于凝乳酶对αs1-CN和β-CN的水解，这种水解通常发生在凝乳过程中凝乳酶对蛋白的过度水解以及成熟干酪中残留的凝乳酶对蛋白的水解[38]，αs1-CN是一条富含脯氨酸的由199个氨基酸构成的单链磷酸化蛋白质，在干酪成熟过程中易被降解产生苦味肽。β-CN中易感Leu192-Tyr193肽键水解后将会产生的β-CN f193-209肽段，这些肽段的产生与积累是干酪苦味的重要来源[39]。总而言之，对于微生物凝乳酶所生产的干酪，其苦味来源于具有疏水性氨基酸末端、分子量分布于100～6 000 u之间的小肽，这些小肽通常具有较低的苦味阈值，并且苦味的强弱与其疏水性氨基酸含量呈正相关。

3.2 降低干酪苦味的研究

根据微生物凝乳酶产生苦味肽的机理，降低干酪苦味的方法主要通过两种途径实现：一种是通过减少微生物凝乳酶介导凝乳过程中苦味肽的产生；另一种为通过外源因素控制降低干酪中所积累的苦味肽含量。通过选用适宜的凝乳酶、外肽酶、改进干酪的生产工艺等手段可有效降低干酪中的苦味。

3.2.1 选用性状优良的凝乳酶

在选择微生物凝乳酶用于干酪生产时，为降低苦味肽的产生及积累，应选择具有高MCA/PA（凝乳活性/非特异性蛋白水解活性值）以及热敏性微生物凝乳酶；在微生物凝乳酶介导的凝乳过程中，不当的MCA/PA值会导致苦味肽的大量产生及积累，而非热敏性的凝乳酶在凝乳过程完成后，无法完全灭活，导致干酪在储存及货架期内仍然具有苦味肽及产生及积累。

为得到性状优良，适用于干酪生产的微生物凝乳酶，科学研究工作者结合相关生物技术，如：蛋白质工程、基因工程等手段获得了丰富的微生物凝乳酶资源；为从源头解决干酪苦味的难题提供了根本性的解决方案。

3.2.2 使用肽酶降解苦味肽

现阶段研究者已发现多种可降解苦味肽的肽酶，这种能有效降低干酪苦味的方法广泛用于各类干酪的生产中，运用较为广泛的两种脱苦的混合外肽酶：Accelase和Debitras能有效降解干酪中的苦味肽，从而降低干酪苦味。随着研究者对苦味肽研究的深入，不断地有新型能降解苦味肽的肽酶被发现，来自Lacto⁃coccus lactis ssp.cremoris Lactococcus lactis ssp.cremoris SK11中的肽酶可有效降解Cheddar干酪中的苦味肽[40]；Tomoko shi Ma Mura等[41]从9株可降解源自β-CN产生的苦味肽的乳酸菌菌株中优选出具有较高的降解苦味肽能力的L.lactis ssp.lactis L.lactis ssp.lactis 527，其产生的肽酶可有效降低干酪的苦味；Bouchier等[42]发现来自Lactis spp.cremoris lactis spp.cremorisAM2中的脯氨酸氨肽酶也能有效降解源自于β-CN产生的苦味肽；Ramarathna Koka等发现[43]从Pseudomonas fluorescens RO98提取分离的蛋白酶能够降解Cheddar和Gouda干酪中的苦味肽。因此，在干酪生产过程添加合适的肽酶可有效降低干酪苦味，得到性状优良的产品。

3.2.3 改进干酪生产工艺

在干酪的生产过程中，可改进干酪生产工艺而减少苦味肽的产生，与其他手段相结合，能够达到理想的减少干酪苦味的效果。

干酪生产过程中的增加盐浓度可显著降低β-CN降解所产生苦味肽的含量，但对αs1-CN的降解效用不明显[44]，在不影响干酪性状的条件下提高盐浓度也是减少苦味肽积累的方法。P.Agrawal等[45]利用超滤浓缩原料乳，减少了发酵剂及凝乳酶的添加量，所得到的低脂Cheddar干酪的苦味明显减少。此外，减少凝乳酶在干酪产品中残余的活性也是抑制干酪苦味产生的方法。

4 微生物凝乳酶的未来发展

预计到2030年大约40%的大规模化学合成工艺将被酶促转化所取代；这与世界酶需求每年增加6.7%的事实相一致，凝乳酶作为食品工业酶制剂的重要组成，面对日益增长的市场需求，结合相关前沿生物技术手段优化提升微生物凝乳酶制剂的上下游生产技术过程是十分重要的。

4.1 定向进化与微生物凝乳酶

除了上文已经提到的DNA重组技术和非定向诱变技术，生物信息学的分子设计被广泛应用于各类酶催化性能的优化及合理合成技术的未来发展中，如定向进化。

定向进化是利用修饰酶以提高催化性能的最有效和实用的手段。基于合理设计的定向进化可以进一步改善酶的性质。该技术利用易错聚合酶链反应（ep-PCR），DNA改组，交错延伸过程（StEP）等手段在体[46]外引导选择性压力，使得RNA，蛋白质，代谢途径，遗传过程甚至整个细胞以迭代的方式进化[47]，再对特定功能或性质进行高通量筛选；通过建立稳定可靠的表型-基因型关系，可定向地设计培养理想的突变体，从而得到理想性状的酶。本质上，体外定向进化是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。

蛋白质结构域可利用优化其组合或对已有多肽结构进行替换达到进化的目的，这些重组模块的单元可能是蛋白质中简单的二级结构单元或更大一些的多肽片段，此类进化过程可由外显子重组、非同源重组和选择性剪切导致，可挑选组合文库中的蛋白进行规模化随机重组进行模拟[48]，从而达到定向进化的要求。即使定向进化是一种提升酶性状的有效方法，但如何权衡理想的功能性状和必要功能性状之间的关系，仍是阻碍定向进化过程的重要因素。

随着越来越多的产生突变体文库方法的出现（如遗传漂变，循环排列组合，原始基因文库等），以及基于诱变PCR和重组的适应性进化技术，运用这些技术手段设计高通量和超高通量筛选试验可有效提升实验效率[49-50]。最近，定向进化与计算/计算机/计算机算法的耦合使我们更接近实现理想的生物技术目标，但就现在来说，这些目标的实现仍有很长的路要走[51-56]。

4.2 宏基因组学与微生物凝乳酶

得益于近代高通量DNA测序技术的进步，宏基因组学也迎来了巨大的发展机遇；基于近代大规模并行测序技术的宏基因组学使人们对未知微生物群体环境中的总DNA研究成为可能，从而人们可以根据理想的性状得到与此性状相关的基因序列，可以定向地从复杂、未知的微生物群体环境中得到理想的酶或微生物。

相较于运用蛋白质工程手段的工程酶获取方式，宏基因组学无需对微生物或酶进行分离、提纯，对酶的相关结构没有硬性的特殊要求，理论上来说，宏基因组学是一种无需依赖培养，能够对复杂微生物环境中的任一DNA进行研究的方法，可从丰富的微生物群体中无限制地获取理想性状的酶；但现实不尽如人意，从宏基因组学理论提出到现在，过去的20年中，已有超过2100个国家及地区运用过这种技术，60%的研究对象来源于海洋样品，所有的研究中只有11%定性了找到的新酶，值得注意的是，在这些有限的研究成果中，只有6100种具有活性的酶被提取出来。

现阶段仍有95%的微生物未被人们发现，其中蕴含着可改变人类文明进程的生物资源宝库，宏基因组学就是开启宝库的钥匙，对于未来日益严峻的资源匮乏情况，宏基因组学的应用和进步是十分重要的。

4.3 蛋白质工程与微生物凝乳酶

利用蛋白质工程的原理及方法探寻微生物凝乳酶中结构与功能性质、辅酶与功能性质、基团及氨基酸与功能性质之间的联系，从而对凝乳酶进行定向改造，合理修饰改进微生物凝乳酶的相关结构，使其一级或高级结构发生可控的、系统的改变，从而得到具有高凝乳活性、良好底物专一性、高热稳定性等酶学特性凝乳酶，也是一种具有广阔发展前景的方法。得益于现代生物技术的发展，科研工作者们在这一领域已取得了一定的进展。

Mantafounis[57]等利用凝乳酶局部氢键网络结构中天冬氨酸活性中心周围的残基对底物裂解的速率及反应最适PH的影响，通过寡核苷酸突变将设计好的突变体导入至凝乳酶B中的cDNA中，利用pCT70在大肠杆菌中成功表达产生的凝乳酶突变体最适PH朝碱性偏移，并对其底物特异性造成了一定影响。Suzuki等[58]等人用17种氨基酸替换了微小毛霉所产凝乳酶中的Tyr-75，替换氨基酸为Asn时，酶的催化效率显著提高，替换氨基酸为Phe时，酶活性明显下降，其他15个样本几乎无活性。Huang K等[59]对凝乳酶中存在的二硫键与其性质的联系进行了研究，实验结果表明：位于Cys250-Cys283的二硫键对于凝乳酶的正确折叠与催化活性是必需的。

随着研究程度的进一步加深，人们可预见通过蛋白质工程定向设计与改造生产具有需怡特性的微生物凝乳酶，并结合相关技术手段将其大规模应用于食品行业。

5 总结及展望

自1961年以来，世界干酪产量大约增加了3.5倍，而小牛皱胃酶供应量却呈下降趋势[60]。目前，世界小牛皱胃酶供应量仅能满足全球干酪产量的20%～30%。面对凝乳酶资源短缺、传统小牛皱胃凝乳酶带来的宗教文化矛盾，使得微生物凝乳酶的研究成为乳品科学领域近年来的热点之一。

得益于近代生物技术的进步，人们可以更好的了解利用微生物这一宝藏；不仅可以更加快速便捷地发现新的微生物，并且可以按需求对其进行改造。但即使在这样的环境下，对于微生物凝乳酶而言，还有很长的一段路要走，现阶段真正运用于工业化酶制剂及干酪制作的微生物凝乳酶无论是种类还是功能均不尽如人意，摆在研究人员面前的难题依然很多，包括如何平衡干酪中蛋白质的水解程度、低成本的发酵及纯化分离方法、以及如何满足不同要求的生产工艺等；但微生物凝乳酶这一食品资源的潜力是毋庸置疑的。推动新型微生物凝乳酶及相关乳制品的研究开发，不仅有利于乳品领域中酶制剂创新水平的提高，也能将科研成果更好地反哺市场，对促进我国乳品行业的发展具有重要的意义。