宋朝阳，汪 月，杨晓丽，张 炎，文鹏程，乔海军，张卫兵,*，张忠明,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省商业科技研究所有限公司，甘肃 兰州 730000；3.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070）

凝乳酶是干酪生产中重要的酶制剂，它可以水解αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白中的特定肽键，特别是对κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽键具有高特异性的裂解作用，使酪蛋白胶束失稳，最终聚集形成凝乳[1-2]。动物源凝乳酶具有良好的凝乳性能、可接受性高、提取方便，是奶酪生产的最佳选择，但是有限的动物资源限制了凝乳酶的产量[3]，因此，寻找凝乳酶替代物是该领域的研究热点，为了满足凝乳酶的市场需求，以食用昆虫为资源开发新型凝乳酶具有良好的前景。

黄粉虫（Tenebrio molitor），俗称面包虫，属于鞘翅目动物。黄粉虫幼虫含有丰富的蛋白质、酶类及生物活性物质，是一种优质的可食性昆虫资源。它生长迅速，成本低，对环境的负担较小，已经广泛应用于食品、医药和饲料等领域[4]，但是黄粉虫幼虫体内含有微量的苯醌毒物，加工中必须严格清杂排毒保证食用的安全性[5]。目前，对于黄粉虫的研究报道主要集中在纤溶性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶和几丁质酶等方面[6-7]，而关于黄粉虫凝乳酶（Tenebrio molitorrennet，TMR）的研究鲜有报道。

酶诱导凝乳的形成是干酪生产中的关键步骤，它直接影响最终产品的质量。凝乳形成过程中，温度对于凝乳酶的凝乳特性、凝乳结构以及干酪质量和风味等的影响极为重要。适宜的温度会增加酪蛋白胶束碰撞的频率，导致凝乳速度加快，较低的温度很难破坏酪蛋白胶束的稳定性，酪蛋白的聚集度降低，温度过高会导致凝乳酶失活[8]。李贻珍等[9]的研究表明凝乳温度升高，蛋白质之间的相互作用增强，显著影响凝乳酶的凝乳性能。目前，温度对TMR凝乳性能影响的研究鲜见报道。

因此，本实验以实验室自制TMR为研究对象，探究凝乳温度对其凝乳行为、水解特性及凝乳结构的影响，旨在为新型昆虫凝乳酶的开发及在乳品工业中的应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TMR冻干粉（纯化倍数66.52，比活力268.09 SU/mg），本实验室自制；商品凝乳酶（commercial rennet，CR）北京爱多特生物技术有限公司；荷尔斯坦牛乳 甘肃农业大学的奶牛场；脱脂乳粉 内蒙古伊利乳业有限责任公司。

三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司；茚三酮 天津市光复科技发展有限公司；异硫氰酸荧光素酯（fluorescein isothiocyanate，FITC） 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS223S型电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；H/T16MM台式高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；HH-8电热恒温水浴锅 常州市亿能实验仪器厂；PHS-3C pH计 上海雷磁仪器厂；DiscoveryHR-1混合流变仪 美国TA Instruments公司；Bettersize2600激光粒度分布仪 丹东百特仪器有限公司；UV-650紫外-可见分光光度计 中科瑞捷（天津）科技有限公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LSM 800型激光扫描共聚焦显微镜 德国蔡司股份公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 凝乳酶液的配制

凝乳酶采用离子交换层析分离纯化，使用冷冻干燥机制得凝乳酶粉，贮藏在-80 ℃。然后称取1 g凝乳酶冻干粉，加入适量磷酸盐缓冲液（0.5 mol/L，pH 7.0）溶解配制成凝乳酶液，适当稀释后采用Arima法在35 ℃测定其酶活力为150 SU/mL。

1.3.2 凝乳的制备

将牛乳在3 000hg条件下离心10 min脱脂，然后分别在35、40、45、50、55、60 ℃条件下水浴10 min，加入体积分数10%同等条件下预热的凝乳酶液，快速混匀，凝乳1 h，排出乳清，得到凝乳。

1.3.3 凝乳持水力和乳清OD值测定

凝乳持水力的测定参照赵笑等[10]的方法进行：将凝乳4 ℃、7 000 r/min离心10 min，取上清液称质量，按式（1）计算乳样持水力：

乳清OD值测定参考吴槟等[11]的方法进行：使用紫外-可见分光光度计测定排出的乳清在波长500 nm处的光密度OD。

1.3.4 凝乳粒径分布的测定

采用动态光散射测定[12]，使用冷冻干燥机将凝乳样品冻干，然后直接加到激光粒度分布仪的分散池中，以去离子水作为分散剂，分散剂和凝乳样品的折射率分别为1.33和1.44。

1.3.5 流变学特性

1.3.5.1 凝乳表观黏度的测定

将凝乳样品直接转移到流变仪上，选用夹具40 mm，0°平行板，间隙为1 000 μm，应力为1.0 Pa，频率范围0.1～100 s-1，室温下测定凝乳的表观黏度[13]。

1.3.5.2 凝乳过程中储能模量（G′）的测定

使用混合流变仪测定牛乳样品的流变特性[14]。将脱脂牛奶分别在35、40、45、50、55、60 ℃条件下水浴10 min，取5 mL牛奶样品，加入0.5 mL同等条件下预热的凝乳酶，混合30 s，然后立即转移至流变仪上，选用夹具40 mm，0°平行板，间隙为1 000 μm，频率为1 Hz，应力为0.1 Pa，数据采集点间隔为10 s。所有测试都在线性黏弹性区域进行，测量的参数为储能模量（G’），每次测试时间为1 h。

1.3.6 乳清中酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）含量和水解度的测定

乳清前处理：将乳清在沸水浴中灭酶后，9 000hg离心10 min去除乳清中的残余凝乳，然后加入三氯乙酸进一步除杂，过滤。

CGMP含量的测定[15]：取2 mL唾液酸标准溶液，加入间苯二酚试剂工作液2 mL煮沸15 min，然后迅速冷却，加入4 mL有机溶液乙酸丁酯和正丁醇（85∶15，V/V），摇匀，37 ℃水浴中提取5 min后，在4 ℃、2 860hg离心10 min，在波长580 nm处测定上层有机物的吸光度。唾液酸的标准曲线方程为y=24.671x+0.064，R²=0.991。然后取2 mL前处理后的乳清样品，按上述步骤测定吸光度。CGMP含量按式（2）计算：

式中：A为乳清样品的吸光度；V1为乳清样品的体积/mL；V2为脱脂牛乳的体积/mL。

水解度测定采用茚三酮比色法[16]，以甘氨酸为标准品。取稀释后的甘氨酸2 mL，然后加入2 mL茚三酮显色剂，混合后在沸水浴中加热15 min，迅速冷却，加入5 mL体积分数40%的乙醇溶液，混匀后放置15 min，然后在波长570 nm处测定吸光度。甘氨酸的标准曲线方程为y=0.054 1x+0.009 7，R²=0.998。另取2 mL同样稀释的乳清样品，按上述方法测吸光度。水解度按式（3）计算：

式中：C为蛋白质质量浓度/（g/L）；W为蛋白质量/g；V1为水解液的总体积/mL；V2为显色时所用稀释液的总体积/mL。

1.3.7 凝乳中蛋白二级结构的测定

采用傅里叶变换红外光谱仪进行红外分析[17]。将冻干后的凝乳样品平铺在采样器附件ZnSe晶片上，设置分辨率为4 cm-1，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.8 凝乳微观结构观察

参考Koutina等[16]的方法略作修改。将5 mL脱脂乳与0.05 mL FITC（0.1 mg/mL）在10 mL离心管中混匀，2 min后加入0.5 mL凝乳酶充分混匀。然后吸取0.5 mL至带有凹槽的载玻片上，盖上盖玻片在35 ℃孵育30 min，然后倒置并利用激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，CLSM）对凝乳样品进行观察。

1.4 数据处理与统计分析

实验数据均重复3次，采用SPSS 19.0统计软件进行显著性和相关性分析，数据采用 fs表示，采用Origin 2018进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 温度对凝乳持水力和乳清OD值的影响

持水力是反映凝乳稳定性的重要参数，也是评价凝乳品质的重要指标之一[9]。如图1A所示，TMR凝乳的持水力随温度的升高呈增大趋势，当温度由40 ℃升高至55 ℃时，TMR凝乳的持水力由82.51%增加到86.69%；CR凝乳的持水力在35～45 ℃显著增大（P＜0.05），45～60 ℃差异不显著（P＞0.05）；而且在不同温度条件下，TMR凝乳的持水力均显著大于CR凝乳。这可能是因为较低的凝乳温度下，维持酪蛋白胶体状态的疏水相互作用减弱，更多的疏水基团暴露，导致持水力较低[18]；同时，由于TMR对温度比较敏感，因而随着温度的升高，疏水作用力逐渐增强，持水力显著增大。赵笑等[10]的研究表明温度升高，TMR的活力提高，凝乳速度加快，包裹在凝乳结构中的水分增多，因而持水力增大，这与本研究结果一致。

图1 持水力和乳清OD值的变化Fig.1 Changes in water-holding capacity and whey OD value of curd with preheating temperature of milk

乳清OD值可以反映排出乳清中的蛋白含量变化，乳清OD值越大，凝乳性能越差[9]。如图1B所示，TMR的乳清OD值随温度的升高显著减小（P＜0.05），而CR的乳清OD值则随温度的升高变化不显著（P＞0.05）。当温度由35 ℃升高至45 ℃时，TMR的乳清OD值迅速下降到0.253，继续升高温度，乳清OD值基本稳定。当温度升高至45 ℃后，2种凝乳酶的乳清OD值差异较小，凝乳性能相近。可能的原因是TMR的最适作用温度低于CR，随着温度升高，TMR活力逐渐增强，参与凝乳的蛋白增多，乳清OD值降低[18]。Anema等[19]的研究发现凝乳温度的升高会增加酪蛋白的聚集能力，这可能是由于空间位阻或与酪蛋白胶束相关乳清蛋白导致电荷减少引起的。

2.2 温度对凝乳粒径的影响

表示粒度特征关键指标的D10、D50、D90分别代表该样品的累积粒度分布的百分数达到10%、50%和90%时所对应的粒径值，其中D50表示样品的平均粒径；D（4,3）表示样本的体积平均粒径，其更能反映微量的大直径粒子的存在[20]。

如图2所示，2种酶凝乳的粒径分布随温度的升高均趋于正态分布。这与Brishti等[21]的研究结果一致，可能的原因是随凝乳温度的升高，酪蛋白胶束聚集形成稳定的蛋白结构，粒径增大；当温度高于45 ℃，TMR逐渐失活，蛋白水解活性增强，酪蛋白聚集形成松散的凝乳结构，蛋白粒径减小。从表1可以看出，随温度的升高，2种酶凝乳的粒径均先增大后减小（P＜0.05），45～55 ℃ TMR凝乳的平均粒径差异不显著（P＞0.05）；且TMR凝乳在45 ℃的粒径值显著大于CR凝乳的粒径值，凝乳性能较好。这是由于TMR的最适凝乳温度小于CR，随温度的升高，TMR凝乳中蛋白质分子间较强引力形成稳定的凝聚结构[18]。

图2 凝乳粒径分布的变化Fig.2 Changes in particle size distribution of curd with preheating temperature of milk

表1 凝乳粒径值的变化Table 1 Changes in particle size distribution parameters of curd with preheating temperature of milk

2.3 凝乳温度对流变学特性的影响

2.3.1 凝乳温度对表观黏度的影响

表观黏度反映凝乳结构的稳定性，表观黏度大，蛋白质分子之间的连接更加紧密，凝乳体系越稳定[22]。由图3可知，凝乳的表观黏度均随着剪切速率的增加逐渐降低，表现出剪切变稀的假塑性，符合非牛顿流体特性[23]；同一剪切速率下，不同温度对凝乳表观黏度的影响存在差异。而且随温度的升高，TMR凝乳的表观黏度先增大后减小，45 ℃达到最大值0.51（图3a）；CR凝乳的表观黏度则随温度的升高不断增大（图3b）。Zhao Zhengtao等[23]的研究发现温度的升高增加了体系中的疏水基团，导致酪蛋白胶束间形成了稳定的三维结构，降低了流动性，表观黏度增大；相反，当体系中的疏水基团减少时，凝乳结构变得松散，流动性较强，表观黏度减小，这与本研究的结果一致。45 ℃时2种酶凝乳的表观黏度值差异最小，而且TMR凝乳的表观黏度在45 ℃下的降幅最大，蛋白结构稳定。这是因为在相同的剪切速率下，蛋白结构越稳定的凝乳，其表观黏度的降幅越大[22]。

图3 凝乳表观黏度的变化Fig.3 Changes in apparent viscosity of curd with preheating temperature of milk

2.3.2 凝乳温度对储能模量（G’）的影响

小幅振荡时间扫描已经被广泛用于研究凝乳过程中的黏弹性变化[24]，凝乳属于黏弹性聚合物，其质地受其流变学特性的影响很大[25]。如图4所示，随温度升高，2种酶凝乳过程中的G’均先增大后减小；TMR凝乳和CR凝乳G’分别在50 ℃和40 ℃达到最大值，而且CR凝乳过程中G’显著大于TMR。可能的原因是TMR酪蛋白的最大水解发生在pH 6.2～6.4之间[26]，与脱脂牛乳的pH值接近；而且黄粉虫中含有大量纤溶性蛋白酶，对于凝血块及凝乳具有较大的溶解性[6]；Esteves等[28]的研究发现，温度的升高促使凝乳酶活性显著增加，随凝乳时间的延长，凝乳酶逐渐失活，蛋白水解活性增大，凝乳结构的稳定性被破坏，导致G’降低，这与本研究的结果相似。

图4 凝乳储能模量（G’）的变化Fig.4 Changes in curd storage modulus (G’) with preheating temperature of milk

2.4 凝乳温度对酶解CGMP含量和水解度的影响

凝乳酶的水解特性表现为可定向水解酪蛋白产生CGMP，CGMP上含有丰富的支链氨基酸和生物活性因子，具有调节免疫系统、促进肠道益生菌增殖以及抗氧化等特性，可以提高乳制品的附加值[29]；水解度代表水解过程中蛋白质肽键被裂解的程度[30]。由图5A可知，在35～45 ℃，TMR酶解产生的CGMP含量和水解度显著增加（P＜0.05），在45～55 ℃温度范围内，两者均变化不显著（P＞0.05）。由图5B可知，随温度升高，CR酶解产生的CGMP含量显著降低，水解度显著增大（P＜0.05）。这是因为随温度升高，κ-酪蛋白的水解程度逐渐达到80%，Ca2+与酪蛋白胶束间形成了稳定的化学键，使部分CGMP不能测定出来，因而CGMP含量增加缓慢，水解度下降，这与赵存朝等[12]的研究结果一致。与CR相比，当温度升高至45 ℃时，TMR酶解产生的CGMP含量变化不显著（P＞0.05），且2种凝乳酶的水解度相近；Anema等[19]温度的持续升高会促进β-乳球蛋白与副-κ-酪蛋白区域形成二硫化键，这种复合物在CGMP被去除后仍将附着在酪蛋白胶束上，阻碍凝乳过程中酪蛋白胶束的聚集。同时，TMR来源广泛、价格低廉、制备工艺简单，可以极大增加其在乳制品中的经济价值。

图5 酶解CGMP含量和水解度的变化Fig.5 Changes in CGMP content and DH of curd with preheating temperature of milk

2.5 温度对凝乳中蛋白质二级结构的影响

小分子与生物大分子之间相互作用引起二级结构的改变[31]，因此采用傅里叶红外光谱研究不同凝乳温度下酶诱导凝乳形成过程中的二级结构变化，红外光谱图中的峰代表不同官能团[32]。如图6所示，在酰胺III带1 330～1 220 cm-1之间，TMR凝乳有2个峰，分别对应üCH3弯曲振动和—NO2对称伸缩；CR凝乳有一个峰，归属为—NO2对称伸缩。因此选择酰胺III带进行拟合，计算二级结构的相对含量如表2所示。

表2 凝乳酪蛋白二级结构的相对含量Table 2 Relative contents of secondary structure in curds

α-螺旋与β-折叠含量比值可以表征蛋白质内部结构的柔韧性，比值越小，蛋白柔韧性越大[33]。由表3可知，随温度升高，TMR凝乳中α-螺旋/β-折叠的比值和β-转角相对含量均呈先减小后增大的趋势，CR凝乳中的α-螺旋/β-折叠的比值和β-转角相对含量随温度的升高呈先增大后减小的趋势。与CR凝乳相比，TMR凝乳在45 ℃时的α-螺旋/β-折叠数值和β-转角最小，无规卷曲含量达到最大值，说明TMR在45 ℃形成不规则的柔韧性和稳定性良好的凝乳结构，且凝乳的柔韧性优于CR凝乳，这与石彦国等[17]的研究结果一致。李柳等[34]的研究发现甲醇芽孢杆菌凝乳酶具有较强的疏水作用，而且其α-螺旋结构明显少于β-折叠结构，因此凝乳酶容易发生降解。因此，凝乳二级结构的变化除了与温度有关之外，还与凝乳酶的分子结构具有相关性。

2.6 凝乳温度对凝乳微观结构的影响

如图7a所示，随凝乳温度的增加，TMR凝乳中的蛋白间隙呈先减少后增多趋势；45 ℃ TMR凝乳中的酪蛋白胶束聚集形成密集的网状结构；由图7b可知，CR凝乳中的蛋白间隙随温度的升高不断增大，凝乳结构逐渐疏松；35 ℃凝乳中的蛋白分布均匀，蛋白骨架也更饱满，凝乳性能良好。这是因为在凝乳过程中，温度的升高使酪蛋白胶束间的疏水作用增强[35-36]。TMR凝乳的水解度在35～45 ℃逐渐增大，酪蛋白胶束被破坏，酪蛋白分子在疏水基团的作用下聚集，形成稳定的凝乳结构，与范金波等[37]的研究结果一致。当温度高于45 ℃时，酪蛋白过度水解，导致凝乳中的蛋白间隙变大甚至发生断裂，出现疏松的絮状结构。赵笑[10]和贺殷媛[38]等的研究也发现类似的结果，即蛋白水解程度越高，蛋白聚集形成的间隙变大，凝乳结构变得越松散。2种凝乳的蛋白结构在45 ℃时差异最小，且TMR凝乳细腻柔软，可塑性更强。

图7 凝乳的CLSM图像Fig.7 CLSM images of curds

3 结 论

为了开发具有良好凝乳性能的新型凝乳酶，本实验以实验室自制TMR为研究对象，探究不同凝乳温度对TMR凝乳行为、水解特性及凝乳结构的影响。结果表明，随凝乳温度的升高，TMR的蛋白水解活性被抑制，TMR的凝乳性能逐渐改善；当温度超过45 ℃时，凝乳酶活性降低，凝乳结构变得疏松；与CR凝乳相比，TMR凝乳的持水力和乳清OD值在45 ℃趋于稳定，粒径显著大于CR凝乳的粒径，凝乳性能较好；同时，TMR凝乳在45 ℃形成了连续不规则且较为致密的网状结构，有利于在干酪中应用。因此，TMR可作为小牛凝乳酶的替代品应用于干酪生产中。