凝乳形成过程及其流变与结构性质的研究进展

2017-08-09刘显庭秦倩罗洁任发政

中国奶牛 2017年7期

关键词：凝乳干酪酪蛋白

刘显庭，秦倩，罗洁，任发政

（1.中粮置地管理有限公司，北京 100020；2.中国青年政治学院，北京 100089；3.中国农业大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083）

凝乳形成过程及其流变与结构性质的研究进展

刘显庭1，秦倩2，罗洁3，任发政3

（1.中粮置地管理有限公司，北京 100020；2.中国青年政治学院，北京 100089；3.中国农业大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083）

凝乳是干酪、酸奶等乳制品生产的关键环节。凝乳形成过程及凝乳性质对乳制品的质构、风味等产品特征都会产生影响。本文归纳了目前国内外有关凝乳的研究，介绍了凝乳形成的原理、不同凝乳的流变与结构性质，为乳制品的开发与生产提供参考。

酸凝乳；酶凝乳；酸酶共促凝乳；流变；结构

凝乳是指牛乳酪蛋白胶束在凝乳酶、酸或热诱导等因素作用下交联形成网状结构凝胶的过程，是干酪、酸奶等乳制品生产的关键环节[1]。乳制品特定的质构、风味与凝乳形成过程及凝乳性质息息相关，人们在生产凝乳制品的过程中，多靠控制凝乳过程及性质来达到控制产品质构与风味特征的目的。因此，凝乳一直以来是国内外研究的热点。

1 凝乳形成的过程

依据凝乳过程中酪蛋白胶束稳定性的破坏原理不同，可将凝乳分为凝乳酶作用诱导形成的酶凝乳，酸化诱导形成的酸凝乳以及凝乳酶与酸化共同作用诱导形成的酸酶共促凝乳。切达干酪、布里干酪、姜撞奶等由酶凝乳方式生产，农家干酪、夸克干酪、奶油干酪、新疆奶疙瘩、蒙古奶豆腐等由酸凝乳方式生产，部分大块型干酪（例如大块型农家干酪、夸克干酪）由酸酶共促凝乳方式生产[2]。

1.1 酶凝乳形成过程

目前，超过75%的干酪是以酶凝乳的方式生产，且所有需要经过成熟的干酪都是通过酶凝乳方式生产的。酶凝乳是牛乳经标准化、巴氏杀菌、均质等前处理，并酸化至一定pH时，加入特定的凝乳酶使牛乳继续酸化与酶解形成凝块的过程。牛乳中酪蛋白胶束通过表面带负电荷的毛发层产生空间位阻作用，使胶束结构得以稳定存在，而凝乳酶通过特异性地水解κ-酪蛋白肽链的Phe105和Met106之间的肽键，释放亲水C端的酪蛋白巨肽，降低了胶束的稳定性，使凝块形成[3]。根据目前文献报道，可以将酶凝乳的形成过程分为两个阶段（图1），而在实际生产中两个阶段重叠、同时发生。

图1 酶凝乳形成的两个阶段

目前关于阶段一的研究报道已经有较清楚的认识[4]。阶段一发生的变化是酪蛋白的水解。当凝乳酶作用于酪蛋白胶束表面的κ-酪蛋白，会使105～106位的苯丙氨酸和蛋氨酸之间的肽键发生水解，产生N端的副κ-酪蛋白和C端的酪蛋白巨肽（或酪蛋白糖巨肽）。这一过程直接导致了酪蛋白胶束之间静电斥力和空间位阻作用的降低。有研究表明，酪蛋白胶束粒径的大小对酶凝乳形成具有显著性影响，酪蛋白粒径越小，则形成的凝乳强度越大[5]。同时，酪蛋白巨肽共有9种，所有的酪蛋白巨肽都能在2%的三氯乙酸中溶解，仅糖基化的酪蛋白巨肽能在高浓度的三氯乙酸中溶解[6]。因此，三氯乙酸可溶性氮的含量可作为观测第一阶段发生的指标。

阶段二的变化是酪蛋白的聚集。经过凝乳酶的作用形成的糖巨肽是可溶的，可以直接释放到乳清当中。当85%以上的酪蛋白被分解时，且温度大于20℃时，副κ-酪蛋白在乳中钙离子的作用下，彼此之间形成“钙桥”，使副κ-酪蛋白相互凝聚，最终产生凝胶[7]。

1.2 酸凝乳形成过程

酸凝乳是利用乳酸菌发酵分解乳糖产酸或添加食用酸使原乳pH值下降从而诱导酪蛋白胶束聚集。有关酸凝乳形成的机理一直以来都是研究的热点，目前研究者提出了酸凝乳的数学模型，如胶球模型、分形模型等[8]，尽管对这些模型存在争议，但对酸化过程中的基本结构变化达成了共识。

图2 酸化对酪蛋白胶束内外钙、磷平衡的影响[9,10]

与酶解作用于酪蛋白胶束表面不同，酸化不仅作用于表面，还作用于胶束内部。牛乳的pH一般为6.7左右，酪蛋白以酪蛋白-磷酸钙复合体形式存在于牛乳溶胶中。酸凝乳酸化的pH约为4.6，即酪蛋白的等电点[11]。小角度X散射试验表明，pH由6.6降到5.3时，胶束内磷酸钙逐渐释放[12]。pH 5.2时，所有磷酸盐溶解，进一步酸化至pH4.6，钙离子完全释放，从而影响酪蛋白胶束内外钙、磷平衡（如图2所示）。尽管磷酸钙释放使酪蛋白之间的磷酸根基团键合作用消失，使酪蛋白单体所带电荷随pH减小而降低，但酪蛋白胶束并不发生解离[13]。Ouanezar等人[14]利用原子力显微镜观察了酪蛋白胶束酸化前后的微观结构，结果表明酸化后胶束粒径减小，酪蛋白失去表面异构性，对矿物质含量与表面负电荷更为敏感。因此，在单一酸化条件下凝乳的性质可通过调节pH而控制。

1.3 酸酶共促凝乳形成过程

在牛乳酸化至一定pH值时，加入少量的凝乳酶，使酸化与凝乳酶共同作用诱导凝乳的形成，即酸酶共促凝乳。由于酸酶共促凝乳过程中涉及导致酪蛋白胶束聚集的两个因素——酸化与酶解，且其影响因素包括切割pH、蛋白浓度、凝乳时的温度及钙离子添加量等[15]，使得凝乳的影响因素更为复杂，从而加大了研究的难度。目前有关酸酶共促凝乳的机制尚未明确，有关研究集中在酸酶共促凝乳过程中的流变等表观性质方面。

由于酸化与凝乳酶交互作用，酸酶共促凝乳形成过程较为复杂。根据相关文献，可将酸酶共促形成凝乳的过程分为以下阶段[16]：①加入发酵剂或化学酸，使牛乳酸化至凝乳酶所需的pH。②加入一定量的凝乳酶，凝乳酶作用的第一阶段开始，κ-酪蛋白被特异性水解。③凝乳酶作用进入第二阶段，酪蛋白胶束发生聚集，促使凝胶形成。④随着pH降低，酶凝型凝胶逐渐转变为酸凝型凝胶，并伴随微量的脱水。⑤在持续酸化作用下，酸凝作用占主导作用，酸凝胶形成。⑥脱水收缩作用增加，酪蛋白收缩，导致微孔收缩（无乳清析出），接着产生大量的脱水收缩（可见乳清析出）。

表1 凝乳流变学性质研究中的主要参数及其意义[18]

通过调节酸化剂与凝乳酶浓度，结合不同的原料比配比，可以实现特定凝乳的控制。Liu等通过构建量化的酸与凝乳酶作用理想模型，比较了不同酸化与酶解凝乳的流变与结构学性质，将酸酶共促凝乳分为酸凝型凝胶、酶凝型凝胶及酸破坏型酶凝胶[17]。因此，进一步探究酸酶共促凝乳形成的过程对于研发新型干酪与指导实际生产具有重要意义。

2 凝乳的流变性质

凝乳为黏弹性聚合物，具有理想固体或液体的特征，可以表征为流变学弹性或黏性参数。流变学通过振荡剪切应力或者应变扫描，可以得到凝乳形成过程及凝胶的信息，包括表示每振荡周期储存能量大小的G′，每振荡周期散失能量大小的G′′，及二者之间的比值tanδ。这些参数与聚合物大分子间的相互作用、凝胶微观结构以及产品的最终感官品质有关[1]。因此，流变实验被广泛应用于凝乳的研究中。

目前，凝乳的流变学研究主要分为凝乳过程与凝块的流变学性质两部分。凝乳过程的流变学性质研究多通过时间扫描等小形变实验，分析弹性模量、损耗正切值等随时间的变化[18]，其具体定义及意义如表1所示。小振幅振荡实验是指在剪切应变小于1%的范围内，凝胶结构在剪切作用下不破坏，在剪切应变作用下，测定相应的剪切应力的变化。凝乳过程中弹性模量的变化可以表征酪蛋白聚集快慢与酪蛋白分子重排作用的强弱。G′是衡量样品剪切过程中每周期储存能量多少的指标，G′越大则样品越趋向于固体，其大小能反映样品中键的数目与强度，G′越小则键的强度越弱或数量越少[18]。tanδ是黏性模量与弹性模量之间的比值，其大小能表征凝胶结构内重排作用的强弱，从而反映凝乳的稳定性，tanδ越大则重排作用越强，凝块结构越不稳定。凝乳过程中一般以tanδ=1.0或G′=1Pa时对应的时间作为凝乳时间，以表征凝乳进行的快慢。

凝块方面，多通过频率扫描实验或大形变实验测定凝块对应力或应变的响应[19]。大形变实验是剪切应力达到最大值或者恒定剪切速率下的扫描实验，得到的屈服应力值或应变值反映凝胶的可塑性及切割、咬食特性。屈服应力值是大形变实验扫描下，样品黏度值突然降低的一点所对应的剪切应力的大小。屈服应力值的大小能反映凝胶的易破碎程度，屈服应力越小则表明凝乳越容易破碎，且凝乳中蛋白间的相互作用键合强度、数目、弛豫时间以及方向都与屈服应力相关[20]。对于凝乳来说，凝块频率扫描下，弹性模量与频率之间一般呈幂律指数关系，幂律模型常用作比较不同凝胶之间黏弹性质的“指纹图谱”，流动性良好的样品符合幂律模型[1]。

时间扫描下，弹性模量随着时间的变化可以监测凝乳的过程，其变化趋势可以表征酪蛋白聚集快慢与酪蛋白分子重排作用的强弱。研究表明，由于疏水作用力的增加，凝乳开始时弹性模量随着时间变化而逐渐增大[21]。在酶凝乳过程中，弹性模量随着凝乳时间的增加而逐渐增大，最后达到一个平稳值，在85～95Pa之间（如表2所示）。而损耗正切值则随凝乳时间增加而逐渐减小至平稳值，小于0.35。在酸凝乳过程中，随着凝乳的形成，弹性模量也随之增大，可达200～220Pa，损耗正切值增加至0.5～0.54之间。

表2 酸凝乳与酶凝乳流变性质比较[1]

然而，对于典型的酸酶共促凝乳，其凝乳过程为弹性模量随酸化的进行先增大到第一个极大值，再稍微降低至极小值，最后再次增大。对应的损耗正切值呈现先迅速减小，然后缓慢增大至极大值，最后持续降低的趋势。根据Lucey等人[22]的研究结果，以pH5.2为分界点可将酸酶共促凝乳分为两个阶段，即当pH＞5.2时，凝乳流变学性质更趋向于酶凝乳，凝乳主要为酶解作用所主导；当pH＜5.2时，则更趋向于酸凝乳，凝乳为酸化作用主导。在pH=5.2时，酸酶共促凝乳有非常高的渗透系数与损耗正切值，表明酪蛋白之间的相互键合作用逐渐弛缓。因此酸酶共促凝乳的过程是由酶凝型凝乳逐渐转变为酸凝型凝乳的过程。

3 凝乳的结构性质

凝乳的结构性质指直接观察到的酪蛋白网状三维结构特征与脱水收缩作用强弱所间接反映的结构稳定性。其中，凝乳网状结构的致密性与孔径大小决定了干酪等乳制品的质地特征，而酪蛋白之间的链接与融合程度对其影响最大。自发性脱水收缩作用是凝乳结构内局部压力作用的结果，表现为凝胶结构不稳定与乳清析出量增加[23]。有研究表明，脱水收缩作用对乳制品的生产具有重要意义，脱水收缩作用的强弱与速度影响着乳制品的水分、酸度、质地、风味等特征。酪蛋白胶束在脱水收缩过程中的分子重排作用加快了凝乳网状结构收缩及凝块乳清析出[14]。控制脱水收缩作用对于改善乳制品的品质具有重要作用。

目前，凝乳微观结构的观察多采用激光共聚焦扫描显微镜与电镜扫描两种手段。其中，虽然电子扫描显微镜很早就已广泛应用于乳制品凝乳过程的研究，但是其观察需要对样品进行多步处理，包括化学固定、脱水干燥、树脂嵌入、切片、着色等过程，且这些处理将影响样品的微观结构，增大实验误差。激光共聚焦显微镜克服了这一弱点，近些年来逐渐应用于食品微观结构的观察，其具有以下特点：样品前期处理少、时间短，无损条件下可获得凝乳三维图像，通过荧光染色特定观察结构组分，并可持续观察凝乳过程[24]。但是其分辨率为0.2μm，无法观察单个酪蛋白分子的结构。因此，凝乳微观结构观察中往往根据不同目的采用不同的观察手段。

酶凝乳是高度集中的基质，包括：副к-酪蛋白磷酸钙脱水网状结构，副к-酪蛋白融合；脂肪球被包裹在网状结构内；水分、乳糖、乳酸、矿物质、水溶性肽、酶类等可溶性物质被副к-酪蛋白包埋；以发酵剂、乳酸菌为主的微生物吸附在脂蛋白表面。其中，蛋白质成分越高，副к-酪蛋白融合程度越高，形成的网状结构的体积分数越高。酸凝乳与酶凝乳的组成成分基本相同，包含蛋白质、脂肪及水分。但是，二者在微观结构方面有区别，主要区别于以下几点[2]：①酸凝乳结构由酪蛋白组成，而酶凝乳结构由胶体磷酸钙通过架桥作用聚合的副к-酪蛋白组成。②由于酸凝乳形成过程中，pH降低至4.5～4.8，胶体磷酸钙大量溶解，且随着乳清的析出而排出，因此，酸凝乳中酪蛋白之间的钙桥作用显著减弱。③酸凝乳网状结构的容积率较低，酪蛋白彼此之间的融合程度较低，使得酪蛋白含量较低，水分含量增加，从而使得酸凝乳网状结构较弱。④酸凝乳中的脂肪球聚合程度较低，因此脂肪球较小。有研究指出，对于奶油干酪等产品来说，均质过程有利于酸凝乳的形成。⑤对于大多数酸凝乳，在切割和/或凝胶破坏后，凝乳颗粒物迅速浓缩，加之水分含量较高导致颗粒物失去其特性，融合形成结构上无缝的连续物，因此，形成的干酪产品无宏观上的结构，表现的较为均匀。

目前，对酶凝乳脱水收缩过程及其影响因素研究较多，而对酸酶共促凝乳只有少量研究报道。根据Steven等人[25]的报道，在酸化初期加入少量凝乳酶时，酸化加快了凝乳酶的酶解作用，使得凝乳网状结构粗糙，凝乳强度增大。随着pH值的进一步降低，凝乳网状结构逐渐形成（图3），酸酶共促凝乳在脱水收缩作用过程中，凝乳网状结构中的酪蛋白逐渐紧密链接或发生融合作用。由于酪蛋白之间发生融合，酸酶共促凝乳经后期搅拌后，较酸凝乳将更加黏稠。Steven等人利用核磁共振技术实时监测了凝乳过程，在pH 5.15时，凝乳形成，此时结构类似于酸凝乳即孔径较小的球状酪蛋白。当pH降到4.78时，凝乳结构发生很大变化，凝乳的孔径增大，分叉更为明显。酪蛋白网状结构由大的酪蛋白聚集物构成，表明小的酪蛋白分子之间已经发生融合。酸化24h后，凝乳pH达到4.56，网状结构中空隙明显。

图3 酸酶共促凝乳与酸凝乳结构的对比[25]

在酸凝乳或酶凝乳中，凝乳的结构学性质与流变学性质存在一定的关联，即高tanδ值说明凝乳脱水收缩作用更强，乳清析量大[18]，从而使得酪蛋白融合加强，凝乳孔径增大。然而，酸酶共促凝乳中tanδ与凝乳结构的关系尚不清楚。Castillo等人[26]的研究表明，凝乳的脱水收缩作用与酸化程度及网状结构形成中，凝乳形成时间、tanδ值大小等指标呈相关性，且凝乳动态与脱水收缩动态具有明显的交互作用，温度与光散射参数建立的数学模型可准确预测乳清的动态析出量。因此，可通过此模型建立监测凝乳与脱水收缩的动态变化，以控制乳制品的最终品质。有关凝乳结构学性质的研究表明，凝乳微观结构与发酵剂浓度、凝乳酶浓度、酪蛋白浓度、胶体磷酸钙的释放量等因素有关，发酵剂浓度越大，凝块脱水收缩作用速度与强度越小、网状孔径越小[27]。

4 结语与展望

目前，对酸凝乳与酶凝乳的机制已有较为清楚的阐述。然而，由于酸酶共促凝乳过程中涉及导致酪蛋白胶束聚集的两个因素——酸化与酶解，使得凝乳过程与凝块性质的影响因素更为复杂。在此过程中，酸化与酶解持续伴随进行而无法得到量化控制，酸化与酶解作用各自对酸酶共促凝乳的贡献难以区分，从而加大了研究的难度[19,25,27,28]。目前有关酸酶共促凝乳的研究多基于模拟酸酶共促凝乳过程，研究凝乳的流变学与结构学性质，但对酸酶共促凝乳机制的研究尚未阐释清楚，有关酸酶共促对凝乳及酪蛋白胶束特性的影响尚不明确。

未来，可以通过模拟温度等环境条件构建量化的酸化与凝乳酶作用的模型，控制酸化与凝乳酶的作用程度，比较不同酸化与酶解程度下牛乳流变学与结构学性质，进一步明确酸化与凝乳酶作用对凝乳形成的贡献，从而为凝乳制品的开发奠定基础。

[1] Lucey JA. Formation and physical properties of milk protein gels[J]. Journal of Dairy Science,2002,85(2):281-294.

[2] Patrick F. Fox TPG, Timothy M. Cogan, Paul L. H. McSweeney.Fundamentals of Cheese Science [M]. Springer US. 2017.

[3] 刘显庭,张昊,郭慧媛,等. 凝乳酶在干酪生产中的应用[J]. 中国乳业,2013,133(1):54-57.

[4] de Kruif CG, Huppertz T, Urban VS,et al. Casein micelles and their internal structure[J]. Advances in Colloid and Interface Science,2012,171-172(0):36-52.

[5] Devold TG,Vegarud GE. Importance of casein micelle size and milk composition for milk gelation[J]. Journal of Dairy Science,2010,93(4):1444-1451.

[6] Zhao Z,Corredig M. Influence of sodium chloride on the colloidal and rennet coagulation properties of concentrated casein micelle suspensions[J]. Journal of Dairy Science,2016,99(8):6036-6045.

[7] Mandy J,Doris J,Harald R. Recent advances in milk clotting enzymes[J]. International Journal of Dairy Technology,2011,64(1):14-33.

[8] Silva NN,Piot M,de Carvalho AF,et al. pH-induced demineralization of casein micelles modifies their physicochemical and foaming properties[J]. Food Hydrocolloids,2013,32(2):322-330.

[9] Ozcan T,Horne D,Lucey JA. Effect of increasing the colloidal calcium phosphate of milk on the texture and microstructure of yogurt[J]. Journal of Dairy Science,2011,94(11):5278-5288.

[10] Koutina G,Knudsen JC,Andersen U,et al. Temperature effect on calcium and phosphorus equilibria in relation to gel formation during acidification of skim milk[J]. International Dairy Journal,2014,36(1):65-73.

[11] Broyard C,Gaucheron F. Modifications of structures and functions of caseins: a scientific and technological challenge[J]. Dairy Science& Technology,2015,95(6):831-862.

[12] Choi J,Horne DS,Lucey JA. Effect of insoluble calcium concentration on rennet coagulation properties of milk[J]. Journal of Dairy Science,2007,90(6):2612-2623.

[13] Heertje,Visser，Smits. Structure formation in acid milk gels[J].Springer Verlag Ny,2014,25(7):545-547.

[14] Ouanezar M,Guyomarc'h F,Bouchoux A. AFM imaging of milk casein micelles: evidence for structural rearrangement upon acidification[J]. Langmuir,2012,28(11):4915-4919.

[15] Grygorczyk A, Alexander M, Corredig M. Combined acidand rennet-induced gelation of a mixed soya milk-cow's milk system[J]. International Journal of Food Science and Technology,2013,48(11):2306-2314.

[16] 李依璇,刘显庭,张昊,等. 酸-酶共促凝乳的研究进展[J]. 中国乳业,2012,125(5):50-54.

[17] Liu XT,Zhang H,Wang F，et al. Rheological and structural properties of differently acidified and renneted milk gels[J]. Journal of Dairy Science,2014,97(6):3292-3299.

[18] Lucey JA. The relationship between rheological parameters and whey separation in milk gels[J]. Food Hydrocolloids,2001, 15(4-6):603-608.

[19] Salvatore E, Pirisi A, Corredig M. Gelation properties of casein micelles during combined renneting and bacterial fermentation:Effect of concentration by ultrafiltration[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(11):848-856.

[20] Pachekrepapol U,Horne DS，Lucey JA. Effect of dextran and dextran sulfate on the structural and rheological properties of model acid milk gels[J]. Journal of Dairy Science,2015,98(5):2843-2852.

[21] Mishra R, Govindasamy-Lucey S，Lucey JA. Rheological properties of rennet-induced gels during the coagulation and cutting process: Impact of processing conditions[J]. Journal of Texture Studies,2005,36(2):190-212.

[22] Lucey JA,Tamehana M,Singh H,et al. Rheological properties of milk gels formed by a combination of rennet and glucono-deltalactone[J]. Journal of Dairy Research, 2000,67(3):415-427.

[23] Rohart A, Michon C, Confiac J, et al. Evaluation of ready-touse SMLS and DWS devices to study acid-induced milk gel changes and syneresis[J]. Dairy Science & Technology, 2016,96(4):459-475.

[24] Auty MA,Twomey M,Guinee TP,et al. Development and application of confocal scanning laser microscopy methods for studying the distribution of fat and protein in selected dairy products[J]. Journal of Dairy Research,2001,68(3):417-427.

[25] Le Feunteun S, Mariette F. Effects of acidification with and without rennet on a concentrated casein system: A kinetic NMR probe diffusion study[J]. Macromolecules,2008,41(6):2079-2086.

[26] Castillo M, Lucey JA, Wang T,et al. Effect of temperature and inoculum concentration on gel microstructure, permeability and syneresis kinetics. Cottage cheese-type gels[J]. International Dairy Journal,2006,16(2):153-163.

[27] Castillo M,Lucey JA,Payne FA. The effect of temperature and inoculum concentration on rheological and light scatter properties of milk coagulated by a combination of bacterial fermentation and chymosin. Cottage cheese-type gels[J]. International Dairy Journal, 2006,16(2):131-146.

[28] Cooper C,Corredig M,Alexander M. Investigation of the Colloidal Interactions at Play in Combined Acidification and Rennet of Different Heat-Treated Milks[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(8):4915-4922.

Advances in Milk Gels Formation and Its Rheological and Structural Properties

LIU Xian-ting1, QIN Qian2, LUO Jie3, REN Fa-zheng3
(1.Cofco Land Management Co. Ltd., Beijing 100020; 2.China Youth University of Political Stuidies, Beijing 100089; 3.The Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health, China Agricultural University,Beijing 100083)

Milk gels formation is a crucial step in the manufacture of dairy product. Milk gels can be produced by acid or rennet, resulting in dairy product with different rheological and structural properties. In this study we reviewed the researches about milk gels formaiton which has been extensively studied. We introduced the gels formation methods and their theories, rheological and structural properties of gels.