王童，逄晓阳，芦晶，杨宝雨，马长路，张书文，吕加平

（中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100093）

0 引 言

红曲类产品因其天然的色泽、特有的风味和营养价值广受中国消费者欢迎[1]。红曲霉发酵产物中含有许多生物活性物质，如莫纳卡琳K，γ-氨基丁酸（GABA）、红曲色素和红曲多糖等，对预防治疗高血压、降低胆固醇、改善血液循环系统等方面都有很好的效果[2-4]。目前，青白霉和白地霉作为干酪中的辅助发酵剂已得到广泛应用[5-6]。将红曲霉用于霉菌干酪的加工，以改善霉菌干酪的风味和营养特性，制作出一款适合中国消费者口味的特色干酪不失为一种新的尝试。

本研究以生牛乳为原料，以霉菌干酪工艺为基础，将红曲霉作为辅助发酵剂，选取红曲奶酪关键操作点设计单因素实验，以凝乳得分为指标进行筛选，在单因素实验基础上结合响应面分析法优化红曲奶酪的加工工艺。

1 实 验

1.1 材料

牛乳，发酵剂，凝乳酶，红曲霉菌种。

1.2 仪器与设备

DELTA 320 pH计，BSA124S-CW型电子天平，HDL超净工作台，LHS150/250 HC-II恒温恒湿箱，UV-1800紫外分光光计，DK-S24电热恒温水浴锅，自制干酪槽，干酪刀，干酪板，模具等。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉干酪加工工艺

原料牛乳→标准化→杀菌（75℃，15 s）→冷却（32℃）→接种乳酸菌发酵剂和红曲霉菌种→发酵（32℃）→加凝乳酶→切割→搅拌→入模排乳清→盐渍（2%）→加后熟菌种（1%）→后熟（12～14℃，RH 95%）

1.3.2 红曲霉发酵液制备方法

将红曲霉在PDA培养基培养3～4 d后，用无菌水洗涤收集孢子得到浓度为1.0×105的孢子液，以5%的接种量接种到已灭菌5%马铃薯全粉溶液中，30℃，200 r/min摇瓶培养4 d，得到色值40 U/mL的红曲霉发酵液，文中红曲霉接种量为红曲霉发酵液添加量。

1.3.3 凝乳效果评价

凝乳效果评价采用加权系数法，以凝乳感官、乳清OD值、凝乳时间、产品得率为指标，进行综合评定。综合评定总分为100分，其中凝乳感官、乳清OD值、凝乳时间、产品得率各为30，30，20和20分；具体评定标准如表1所示。

（1）干酪产品得率计算。干酪产品得率=终产品质量/原料质量×100%。

（2）干酪凝乳时间的确定。从加入凝乳酶到凝乳适宜切割所需要的时间。

（3）干酪凝乳愈合时间的确定。从凝乳切割到开始装入模具所需要的时间。

（4）乳清OD值的测定。根据乳清浓度，适度稀释后在480 nm处测定。

表1 干酪凝乳效果评分标准

1.4 影响红曲奶酪工艺的单因素实验

1.4.1 发酵剂添加量对对红曲奶酪凝乳得分的影响

采用60～65℃，30 min杀菌，发酵剂接种量分别为0.025，0.05，0.1，0.15，0.2 g/L；凝乳酶添加量为40 IMCU/L（IMCU为酶活力单位International Milk-Clotting Units缩写），凝乳温度32℃的工艺制作干酪，测定并计算其凝乳得分。

1.4.2 凝乳酶添加量对对红曲奶酪凝乳得分的影响

采用60～65℃，30 min杀菌，发酵剂接种量0.1 g/L，凝乳酶添加量分别为10，20，40，60，80 IMCU/L，凝乳温度32℃的工艺制作干酪，测定并计算其凝乳得分。

1.4.3 红曲霉接种量对红曲奶酪凝乳得分的影响

采用60～65℃，30 min杀菌，发酵剂接种量0.1 g/L，红曲霉接种量分别为1%，3%，5%，10%的发酵液，凝乳酶添加量为40 IMCU/L，凝乳温度为32℃的工艺制作干酪，测定并计算其凝乳得分。

1.4.4 凝乳愈合时间对对红曲奶酪凝乳得分的影响

采用60～65℃，30 min杀菌，发酵剂接种量0.1 g/L，凝乳酶添加量为40 IMCU/L，凝乳温度为32℃，红曲添加量分别为3%，凝乳愈合时间分别为0，5，10，15 min的工艺制作干酪，测定并计算其凝乳得分。

1.5 响应面法优化红曲霉干酪加工工艺

在单因素实验结果的基础上，采用响应面法中的Box-Behnken实验设计优化红曲奶酪加工工艺选择发酵剂添加量A、凝乳酶添加量B、红曲酶接种量C、凝乳愈合时间D为响应面优化的考察因素，每个自变量因素分别以-1，0，1进行编码，以凝乳得分为响应值(Y)，设计四因素三水平的响应面分析试验，数据采用过Design Expert 8.0.6.1软件分析。

1.6 数据处理

所有试验设定为三次平行试验，试验结果为三次平行试样测定结果的平均值，并进行统计学分析。数据分析采用t检验方法，P≤0.05认为结果显著差异，整个数据处理是采用SPSS 24.0软件。响应面绘制及模型建立采用Design Expert 8.0.6.1软件处理。

表2 中心组合Box-Behnken方案设计因素水平

2 结果与分析

2.1 红曲霉干酪工艺的单因素试验及结果

图1 发酵剂添加量对对红曲奶酪凝乳得分的影响

由图1可知，随着发酵剂添加量的增加，凝乳时间逐渐缩短，但当发酵剂添加量为0.05 g/L时，形成的凝块质地过软，且得率较低。当添加量为0.2 g/L时，凝块质地太硬、粗糙呈颗粒状。发酵剂发酵凝乳块中的乳糖产生乳酸，乳酸引发酪蛋白发生特定的化学变化，使得有些磷酸钙会溶解，乳糖等乳清成分重新进入融入凝块，代替已耗用的组分，凝块内部和周围的酸度增大会进一步引起凝块收缩[10-12]。发酵剂菌株活力越强，产酸速率就越快，凝块收缩程度就越大，排出水分速度也越快。过大的发酵剂添加量，导致产生的乳酸量过多，会造成凝乳快速收缩而析出乳清，形成的凝块粗糙、松散、有渣粒感[13]。凝乳硬度大小是凝乳中网络结构状态的反映，凝乳的质量好坏直接影响到干酪的质构和得率[14]。综合以上试验结果，0.1 g/L的发酵剂添加量效果较好。

图2 凝乳酶添加量对红曲奶酪凝乳得分的影响

由图2可知，随着凝乳酶添加量的增加，凝乳时间逐渐缩短，乳清OD值逐渐减小，得率增加，但添加量为20 IMCU/L时，凝块较软，不易切割；添加量为80 IMCU/L时，凝块质地粗糙，乳清很容易析出。凝乳酶添加量的不同会造成干酪排乳清后酶的滞留量不同，而酶的滞留会影响干酪中的蛋白水解和干酪的功能特性[15]。凝乳酶的量太少，会造成凝乳强度差，在后期切割搅拌过程中,一部分蛋白和脂肪等成分随乳清排出，导致干酪产率降低。凝乳酶量过多，造成过多的酶滞留在干酪中，在干酪后期成熟过程中，过度水解蛋白，产生一些苦味肽，影响干酪风味和功能特性且凝乳的强度较小较软的凝乳[16-17]。雷蕾等研究了凝乳酶的不同添加量对干酪品质的影响添加量越高，蛋白质含量越高，水分含量越低，干酪的硬度、融化性和油脂析出越高。但过多的凝乳酶会造成干酪有更大的蛋白水解，使干酪有苦味[18]。单因素实验结果表明，凝乳酶综合试验结果选择40 IMCU/L的添加量为凝乳酶的最适添加量。

图3 红曲霉接种量对红曲奶酪凝乳得分的影响

由图3可知，随着红曲霉接种量的增加，凝乳时间先缩短后增加，得率也是先增大后减小，添加量为1%，凝乳时间稍长，得率稍低；红曲霉接种量为3%时，得率最大且凝乳时间最短；陆晓斌等人发现，红曲霉发酵液具有一定的凝乳能力，因为红曲霉在生长过程中可以产生一些凝乳酶，所以在一定范围内，当红曲霉发酵液添加量增大时，会对凝乳有一定的促进作用，在干酪生产中可以节约凝乳酶的使用量，降低成本[19-21]。红曲霉接种量为10%时，凝块质地疏松，蛋白质和脂肪流失严重，这主要是因为红曲霉发酵液中的淀粉类物质混入牛奶中，影响干酪凝乳的质地，破坏凝乳的结构；由以上实验结果可知，红曲霉接种量为3%时，凝乳时间较短，凝块质地柔软且富有弹性，且得率较高，比较适合干酪的加工。综合考虑，选择红曲霉接种量为3%为最优接种量。

图4 凝乳愈合时间对红曲奶酪凝乳得分的影响

由图4可知,随着时间的延长，凝乳得分先增大后减小，因为干酪乳酸菌发酵产生的乳酸会显著降低凝乳的pH值，促使凝乳酶的活性增加，加速酪蛋白胶团的产生，促进凝乳的形成[22-23]。但时间过长，也会使胶束中磷酸钙的溶解作用增加，降低了酪蛋白胶团表面的静电荷，使胶团之间的静电斥力下降，从而导致凝乳中乳清大量析出，凝乳块显著收缩，凝乳变硬，弹性变差，产品得率下降；排乳清时间过短时，则凝乳中水分含量较高，凝乳酶残留量增加，同样会对干酪品质产生不利影响[24-25]。结合实验结果综合分析，选择凝乳愈合时间10 min为最优凝乳愈合时间。

2.2 响应面优化糖化工艺试验结果及分析

响应面法优化红曲奶酪加工工艺的Box-Behnken设计及27组实验结果见表7。通过Design Expert 8.0.6.1软件对试验进行回归分析，预测红曲霉干酪加工的最优工艺参数，方差分析结果见表8。对表7中的凝乳得分进行多元回归分析，得到发酵剂添加量（A）、凝乳酶添加量（B）、红曲霉接种量（C）、凝乳愈合时间（D）的二次回归模型，该式表达了凝乳效果（Y）与各因素之间的变化规律，其二次多元回归模型为：

Y=-52.29583+1105.91667A+1.94625B+11.40417C+5.93833D-5.30000AB-33.25000AC+3.00000AD-0.041250BC+7.00000E-003BD-0.18500CD-4143.33333A2-0.017677B2-0.63333C2-0.28983D2。

得到最佳工艺组合为：发酵剂添加量0.1 g/L，红曲霉接种量3.1%，凝乳酶添加量40 IMCU/L，凝乳愈合时间为9.9 min，理论凝乳得分89.53，验证实验3次平均值89.10，与预测值基本吻合。

对建立的模型采用二次型进行分析，利用t检验和P值可判断各相关系的显著性，干酪凝乳效果评分变化所建立的回归模型变量间关系（P＜0.01）极显著，模拟变量失拟（P＞0.05）不显著，表明模型选择正确，模型相关系数R2=0.9825，矫正相关系数R2Adj=0.9620表明响应值的变化能较好的描述各因素与响应值之

表3 发酵剂添加量对红曲奶酪凝乳效果的影响

表4 回归方程的方差分析结果

间的实验结果，模型拟合程度好，实验误差小，可有效分析和预测红曲干酪的凝乳效果。在各因素所选择的水平范围内，二次项A2，B2，C2，D2对凝乳效果评分影响显著。发酵剂添加量(A)、凝乳酶添加量（B）、红曲霉接种量（C）、凝乳愈合时间（D）的交互作用项BC交互作用显著（P＞0.05），AB，AC，CD交互作用极显著（P＜0.01）。

2.3 响应面分析

响应面图可以直观的看到各因素间的交互作用情况，圆形表示两因素间交互作用不明显，椭圆形则表示较明显，具体结果如图5所示。

图5 三维响应曲面图

由图5(a)可以看出，发酵剂添加量(A)和凝乳酶添加量(B)存在极显著的相互作用，随着发酵剂和凝乳酶添加量的增加，凝乳效果得分均呈现先升高后降低的变化。添加发酵剂主要作用是产酸，是牛奶的p H降低，提高凝乳酶活力，促进凝乳酶作用形成凝块，是凝块收缩容易排除乳清[26]。结合响应面可以看出，发酵剂、凝乳酶添加量小，凝乳温度低得到较差凝乳效果，这与前期单因素分析一致，但过高的凝乳酶、氯化钙添加量和凝乳温度也会降低凝乳效果。由图5(b)可以看出，发酵剂添加量(A)和红曲霉接种量(C)存在极显著的相互作用，因为红曲霉发酵液中含有少量的凝乳酶，且红曲霉发酵液呈酸性，加入后可以提高牛奶的酸度，故AC的交互作用和AB的交互作用类似，即随着发酵剂和红曲霉发酵液添加量的增加，凝乳效果得分均呈现先升高后降低的变化。发酵剂添加量(A)凝乳酶添加量（B）和凝乳愈合时间(D)的交互作用不明显。由图5(c)可以看出，凝乳酶添加量（B）和红曲霉接种量（C）的交互作用显著，随着凝乳酶和红曲霉接种量的增加，凝乳效果得分均呈现先升高后降低的变化。因为红曲霉发酵液中含有少量凝乳酶，酸性的发酵液加入牛奶后还可以提高牛奶的酸度，在凝乳阶段提高凝乳活力。由图5(d)可以看出，红曲霉发酵液添加量(C)和凝乳愈合时间(D)存在极显著的相互作用，排乳时间很大程度上决定凝乳块终水分的含量，因此对于凝乳块的质地有显著影响，凝乳时间过长或过短均不利于良好凝乳的形成[27]。凝乳时间较短时，凝乳块水分含量大，质地柔软，弹性较差；凝乳时间较长时，凝乳块的质地显著变硬，收缩严重，弹性差，易碎，排乳时间在30 min左右时，凝乳块质地细腻，弹性较好[28]。红曲霉发酵液中含有少量凝乳酶，少量加入有利于凝乳形成，而添加量较大时，发酵液中的淀粉等物质由于无法溶解与牛奶中，在凝乳阶段会影响凝乳快的质地，使其硬度和弹性变差。

3 结 论

利用响应面法对红曲奶酪加工工艺进行优化，建立了发酵剂添加量、凝乳酶添加量、红曲霉接种量、凝乳愈合时间对凝乳效果的二次回归方程模型，经检验，模型准确有效，可以用该模型分析预测上述因素对凝乳效果的影响。结合前期单因素实验数据和响应面优化模型确定红曲奶酪加工工艺为：发酵剂添加量0.1 g/L，红曲霉接种量3.1%，凝乳酶添加量40 IMCU/L，凝乳愈合时间为9.9 min，理论凝乳得分89.53，验证实验3次平均值89.10，与预测值基本吻合。该研究表明，Box-Behnken设计-响应面法可有效地优化红曲奶酪加工工艺。