顾冰飞，赵圆圆，陈义勇

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

锌是生物体正常生长发育所必需的微量元素之一，是很多种酶的活性中心物质，发挥着催化和调节的作用[1]。研究表明，缺锌会导致儿童发育迟缓[2]、心血管疾病[3]、学习记忆能力降低[4]等。目前补锌剂多以无机形式存在，无机锌不易吸收且摄入过多会产生一定的毒害作用，与无机锌相比，有机锌易被人体吸收且生物学效价高[5]。近年来，多糖锌螯合物作为一种有机锌补充剂成为研究热点，目前报道的通过人工合成的多糖锌螯合物如金针菇多糖-Zn2＋螯合物[6-7]、肉苁蓉多糖锌[8]、蛹虫草基质多糖锌配合物[9]、酵母多糖锌配合物[10]、猪苓多糖锌配合物[11]等，研究发现这些人工合成的多糖锌复合物有望被开发成一种新型补锌剂。

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，隶属伞菌目、侧耳科、侧耳属，是一种珍贵食用菌[12]。多糖是杏鲍菇主要成分之一，目前对杏鲍菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharides，PEP）研究主要集中在生物活性如抗肿瘤[13-14]、降血糖[15]、抑菌[16]、保湿[17]、抗疲劳[18]、提高免疫力[19]等及提取[20-23]、乙酰化修饰[24]、羧甲基化修饰[25]等方面。金属离子如 Fe2＋、Co2＋、Cu2＋、Zn2＋等对硬软配体都有一定亲和性，能分别与软硬离子竞争配体形成络合物[26]。多糖与锌离子的螯合原理主要是由于多糖中的-OH和-COO-与锌离子发生了配位[8]。但对于杏鲍菇多糖与微量元素的螯合及其生物活性的研究尚未见报道。

因此本研究以PEP为对象，通过响应面分析法优化杏鲍菇多糖锌螯合物（Pleurotus eryngii polysaccharides-zinc（II）chelate，PEP-Zn）的制备工艺，通过红外光谱PEP和PEP-Zn结构进行初步表征，并对PEP和PEP-Zn的抗氧化性进行研究，为开发杏鲍菇多糖锌螯合物这一新型具有抗氧化活性的补锌剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇：常熟市农贸市场；DPPH：深圳欣博盛生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷：苏州亚科科技股份有限公司；硫酸锌、水杨酸、焦性没食子酸、过氧化氢、无水乙醇、盐酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DF-101S恒温加热磁力搅拌器：金坛市友联仪器研究所；722型数显可见分光光度计：上海光学仪器五厂有限公司；小型高速粉碎机：山东维诺医药设备制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：北京成萌伟业科技有限公司；HH-2智能数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SHB-B95循环水式多用真空泵：郑州世纪双科实验仪器有限公司；IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪：日本岛津公司；TAS-990原子吸收分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 PEP的制备

杏鲍菇经过洗涤、干燥、粉碎过筛，按料液比1∶30（g/mL）将杏鲍菇粉和蒸馏水混合，90℃热水浸提 3 h，离心（4 000 r/min，10 min）后合并上清液，用Sevage法[27]除去上清液中的蛋白，离心后收集上清液，然后加入4倍体积的95%乙醇，4℃醇沉24 h后离心（4 500 r/min，15min），将沉淀冷冻干燥得到 PEP。

1.3.2 PEP-Zn的制备

PEP-Zn的制备参考黄靖等[8]的方法并根据预试验结果对试验参数进行调整。准确称取0.25 g杏鲍菇多糖溶于100 mL蒸馏水，充分溶解得到2.5 g/L的多糖溶液。取25 mL多糖溶液然后加入等体积的ZnSO4溶液（0.15 mol/L），调节混合液pH值为5，然后50℃条件下搅拌反应3 h。反应液经流水透析48 h，透析液经冷冻干燥后得到PEP-Zn。

1.3.3 PEP-Zn螯合率的测定

锌标准曲线绘制：分别配置浓度为 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mg/L 的 ZnSO4标准溶液，用火焰原子吸收分光光度计测定，横、纵坐标分别为锌离子浓度和吸光度，绘制标准曲线，得到方程：Y=0.272 1X+0.05，R2=0.978 1，式中：Y为吸光度；X为锌离子浓度，mg/L。

将PEP-Zn溶于1L蒸馏水，充分溶解。根据预试验及锌标准曲线的数据，将溶液稀释10倍。稀释液经过滤，用火焰原子吸收分光光度计测定，根据吸光度得出螯合前和螯合后锌离子浓度（mg/L），分别记为C0和C，根据以下公式计算螯合率：

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 螯合时间对PEP-Zn螯合率的影响

取25mL杏鲍菇多糖溶液（2.5g/L）和等体积硫酸锌溶液（0.15mol/L），将两者混合均匀，调节混合溶液pH值为5，螯合温度为50℃，考察不同螯合时间（2、3、4、5 h）对PEP-Zn螯合率的影响，确定最佳螯合时间。

1.3.4.2 螯合温度对PEP-Zn螯合率的影响

取25 mL杏鲍菇多糖溶液（2.5 g/L）和等体积硫酸锌溶液（0.15 mol/L），将两者混合均匀，调节混合溶液pH值为5，螯合时间为3 h，考察不同螯合温度（40、50、60、70℃）对PEP-Zn螯合率的影响，确定最佳螯合温度。

1.3.4.3 螯合pH值对PEP-Zn螯合率的影响

取25 mL杏鲍菇多糖溶液（2.5 g/L）和等体积硫酸锌溶液（0.15 mol/L），将两者混合均匀，螯合时间为3 h，螯合温度为 50 ℃，考察不同螯合 pH 值（4、5、6、7）对PEP-Zn螯合率的影响，确定最佳螯合pH值。

1.3.5 响应面试验设计

以单因素试验结果为基础，采用Box-Benhnken中心组合试验设计，设计螯合时间、螯合温度、螯合pH值三因素三水平的回归方程以拟合各因素与响应值螯合率的关系，利用Design-Expert 8.0.6软件系统进行响应面分析，以得到PEP-Zn的最优制备工艺。

1.3.6 PEP及PEP-Zn的结构表征

将PEP和PEP-Zn粉末充分干燥后，分别取5 mg与KBr充分混匀后压片，进行红外光谱扫描。波数范围 400 cm-1～4 000 cm-1，对 PEP 与 PEP-Zn 的红外光谱图进行对比分析。

1.3.7 抗氧化活性测定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定

配置0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存备用。在试管中分别加入不同浓度的PEP和PEP-Zn溶液 （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）2.0 mL 以 及 2.0 mL DPPH溶液，摇匀、室温下避光反应30 min，于517 nm处进行吸光度测定，2 mL蒸馏水分别代替PEP和PEP-Zn溶液及2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L）反应作为空白参比，测定OD517值，以蒸馏水作参比调零[28]。DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：A1为蒸馏水替代DPPH测得的吸光度；A2为不同浓度PEP及PEP-Zn测得的吸光度；A3为蒸馏水替代PEP及PEP-Zn测得的吸光度。

1.3.7.2 羟基自由基清除能力的测定

配置9.0 mmol/L的FeSO4溶液，9.0 mmol/L的水杨酸乙醇溶液以及8.8 mmol/L的H2O2溶液备用。分别向各试管中加入1 mL的FeSO4、1 mL的水杨酸乙醇溶液，混匀后加入不同浓度的PEP和PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）1.0 mL，再加入 1.0 mL H2O2启动反应。混匀后于37℃水浴加热反应30 min，测定OD510值[29]。羟基自由基的清除率计算公式如下：

式中：A1为以蒸馏水代替水杨酸测得的吸光度；A2为不同浓度PEP及PEP-Zn测得的吸光度；A3为以蒸馏水代替不同浓度PEP及PEP-Zn测得的吸光度。

1.3.7.3 超氧阴离子自由基清除能力测定

配置 50 mmol/L，pH 8.2的 Tris-HCl缓冲液，7 mmol/L焦性没食子酸溶液，10 mol/L HCl溶液备用。向试管中加入4.5 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.2），1 mL不同浓度的PEP及PEP-Zn溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）以及 3.2 mL 蒸馏水，混匀后于25℃水浴20 min。随后加入0.3 mL邻苯三酚溶液（7 mmol/L），摇匀，25℃水浴加热3 min后立即滴入1滴HCl（10 mol/L）溶液终止反应，测定OD325值[30]。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下。

式中：A为不同浓度PEP及PEP-Zn测得的吸光度；A0为以蒸馏水代替不同浓度PEP及PEP-Zn测得的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 PEP-Zn的制备工艺优化

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 螯合时间对PEP-Zn螯合率的影响

螯合时间对PEP-Zn螯合率的影响见图1。

图1 螯合时间对PEP-Zn螯合率的影响Fig.1 Effect of chelating time on the chelation rate of PEP-Zn

根据图1，螯合时间对PEP-Zn的螯合率影响较为显著。在2 h～4 h，随着螯合时间不断增长，螯合率显著上升。螯合时间达到4 h时，螯合率达到最大值53.6%。超过4 h后，随着螯合时间的增长，螯合率逐步表现出下降势态。其主要原因在于延长了螯合时间，促使PEP与硫酸锌两者有了更为紧密的接触反应，使得螯合率不断升高。但是螯合时间的不断延长，在一定程度上破坏了体系的稳定性，使其副反应的发生率增高，导致部分配合物开始解离，从而造成螯合率的显著降低[25]。因此PEP-Zn制备的最佳螯合时间为4 h。

2.1.1.2 螯合温度对PEP-Zn螯合率的影响

螯合温度对PEP-Zn螯合率的影响见图2。

根据图2可知，螯合温度对PEP-Zn螯合率影响较为显著。在40℃～60℃之间，随着螯合温度持续升高的情况下，螯合率呈现出不断增长的趋势。温度在60℃的条件下，螯合率升到最大值44.9%。但是当螯合温度大于60℃并继续升高时，螯合率表现出下降的态势。主要原因可能是，螯合温度在一定范围内增加，促进PEP的溶胀，利于ZnSO4渗透到多糖颗粒内部，分子间有效碰撞的几率得到增加，使得螯合率显著增大。温度超过60℃后，过高的温度易导致PEP的分解，反而降低了螯合效率。因此PEP-Zn制备的最佳螯合温度为60℃。

图2 螯合温度对PEP-Zn螯合率的影响Fig.2 Effect of chelating temperature on the chelation rate of PEP-Zn

2.1.1.3 螯合pH值对PEP-Zn螯合率的影响

螯合pH值对PEP-Zn的影响如图3所示。

图3 螯合pH对PEP-Zn螯合率的影响Fig.3 Effect of chelating pH on the chelation rate of PEP-Zn

当螯合pH值在4.0～7.0范围内，随着pH值的增大，螯合率先上升后下降。pH值为5时，螯合率达到最大值43.7%。pH值为7时，产生了Zn（OH）2沉淀，不利于螯合反应的进行。因此PEP-Zn制备的最佳螯合pH值为5。

2.1.2 PEP-Zn制备工艺条件优化

2.1.2.1 响应模型的建立与分析

基于单因素试验结果，以螯合率为指标，试验设计因素及水平取值见表1，Box-Behnken试验设计及响应值螯合率结果见表2，方差分析结果见表3。

利用Design-Expert 8.0.6对表2中的数据进行分析，在对各因素进行回归分析后得到响应值螯合率（Y）对螯合时间（A）、螯合温度（B）、pH值（C）的三元二次回归方程：

表1 试验设计因素及水平取值Table 1 Factors and levels designed for response surface analysis

表2 Box-Behnken试验设计及螯合率响应值Table 2 Box-Behnken design with response values for chelation rate

表3 回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3方差分析结果可知，本试验所选用的模型极显著（P＜0.001），且方程失拟项不显著（P=0.293 9＞0.05），说明未知因素对试验影响较小，此模型合适本试验。R2=0.994 0，表明该模型具有相对较优的拟合程度，在评估相关因素对PEP-Zn螯合率的影响时较为准确，可用来对PEP-Zn制备工艺研究进行分析和预测。一次项C因素对螯合率的线性效应极为显著（P＜0.001），交互项 AB、AC、BC 及二次项 A2、B2、C2对响应值螯合率均有显著影响（P＜0.001）。

2.1.2.2 响应面图分析

图4～图6中的响应面三维模型图显示了螯合时间、螯合温度和螯合pH值中任意选取一个变量为零水平时，另外两个变量对PEP-Zn螯合率的影响，据此可分析各影响因素对PEP-Zn螯合率的影响及两因素间的交互作用。

图4 螯合时间和螯合温度对螯合率的影响Fig.4 Effect of chelating time and chelating temperature on chelation rate

图5 螯合时间和螯合pH值对螯合率的影响Fig.5 Effect of chelating time and chelating pH on chelation rate

由图4～图6可知，当一个因素取零水平时，另外两个因素同时发生变化，随着两因素变量的加大，PEP-Zn螯合率呈现先上升后下降的趋势。螯合时间与螯合pH值、螯合温度与pH值及螯合时间与螯合温度之间的交互作用非常显著。

图6 螯合温度和螯合pH值对螯合率的影响Fig.6 Effect of chelating temperature and chelating pH on chelation rate

2.1.2.3 最佳工艺条件确定及验证试验

对响应面试验结果进行分析，根据Design-Expert.V8.0.6软件得到分析数据，可知PEP-Zn制备工艺的最佳工艺条件：螯合时间为3.73 h，螯合温度为58.50℃，螯合pH值为4.29，在该条件下，PEP-Zn螯合率预测值为64.3%。

为确保试验的可行性，验证试验采取的工艺条件适当调整为，螯合时间为4 h，螯合温度为58℃，螯合pH值为4，在该工艺条件下测得PEP-Zn的螯合率为63.8%，与预测值相比，误差较小，说明该模型可行。

2.2 PEP与PEP-Zn红外光谱分析

PEP与PEP-Zn红外光谱分析如图7所示。

图7PEP与PEP-Zn红外光谱图Fig.7 Infrared spectra of PEP and PEP-Zn

PEP与PEP-Zn都具有多糖类物质的红外特征峰，在3 440 cm-1强峰为O-H的伸缩振动峰，在2 900 cm-1波数处是C-H的伸缩振动峰，与PEP相比，PEP-Zn的吸收峰有所减弱。在1 600 cm-1及1 384 cm-1波数处，PEP表现出异常显著的C=O伸缩振动，而PEP-Zn在这两处的吸收峰都有所减弱，揭示Zn2+可能与羧酸或羧酸盐之间形成了配位键，且Zn2+多与C=O基团发生配位反应，加上羟基参与反应，形成强烈的氢键缔合，加强了分子间作用。由于红外光谱给出的结构信息仅仅是相关官能团连接方式及类型[31]，对PEP-Zn的结构反映不全面，因此对其结构需要进一步研究。

2.3 PEP与PEP-Zn的抗氧化活性

2.3.1 PEP与PEP-Zn对DPPH自由基的清除作用

PEP与PEP-Zn对DPPH自由基的清除作用见图8。

图8PEP和PEP-Zn对DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

从图8可知，PEP、PEP-Zn两者对DPPH自由基清除作用明显，且在浓度不断增大的条件下，清除作用也随之增强。与PEP相比，PEP-Zn对DPPH自由基清除作用减弱，原因可能与结合锌离子位点的数目及结合强度有关，导致PEP分子的空间构象发生改变，从而导致PEP-Zn对DPPH自由基清除作用降低，具体原因还需进一步研究。

2.3.2 PEP与PEP-Zn对羟基自由基的清除作用

PEP与PEP-Zn对羟基自由基的清除作用见如图9所示。

图9 PEP和PEP-Zn对羟基自由基的清除作用Fig.9 Hydroxyl radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

当多糖浓度低于1 mg/mL时，PEP及PEP-Zn对羟基自由基的清除作用随着浓度增大而增强。PEP与PEP-Zn对羟基自由基最大清除率分别达到33.8%和42.2%，PEP-Zn对羟基自由基的清除率较PEP有显著提升。可能是因为PEP-Zn与锌配合后，导致配位部分增强与暴露的活性基团之间的作用，进而促进与自由基的作用增大[32]。

2.3.3 PEP与PEP-Zn对超氧阴离子（O2-·）的自由基清除作用

PEP与PEP-Zn对超氧阴离子（O2-·）的自由基清除作用如图10所示。

图10 PEP和PEP-Zn对超氧阴离子（O2-·）自由基的清除作用Fig.10 Superoxide anion（O2-·）free radicals scavenging effect of PEP and PEP-Zn

当多糖浓度低于1 mg/mL时，PEP和PEP-Zn对超氧阴离子自由基的清除作用随浓度增大而增强。PEP与PEP-Zn对超氧阴离子自由基的最大清除率值分别达到14.1%和27%。PEP-Zn对O2-·自由基的清除能力比PEP有明显的提升，这可能是由于PEP与锌配合后，与自由基反应生成的中间体可能更加稳定，导致清除自由基的能力增大[33]。由此可见，对PEP进行锌离子的螯合有利于提升其对超氧阴离子自由基的清除能力。

3 结论

本研究通过响应面法优化确定了PEP-Zn制备工艺的最佳工艺条件为：螯合时间为3.73 h，螯合温度为58.5℃，螯合pH值为4.29，在该条件下，PEP-Zn螯合率为64.3%。与PEP相比，PEP-Zn对DPPH自由基清除作用减弱，对羟基自由基和超氧阴离子的清除率增强，修饰后抗氧化活性变化的机理还不是很清楚，还需进一步深入研究，本研究成果为开发PEP-Zn作为一种新型的具有抗氧化活性的补锌剂提供了一定的理论依据。