牛彪，梁妍，梁剑平，刘宇

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050）

茶树油（tea tree oil，TTO）也称互叶白千层油，从桃金娘科互叶白千层树的叶和嫩枝中利用水蒸气蒸馏法提取得到的一种无色至淡黄色油状液体，具有怡人的芳香气味。属白千层萜品型香料油，具有良好的杀菌抑菌及保健作用。原产于澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区[1]。中国自20世纪90年代开始，先由广东、广西、海南、福建、云南等地开始引种，并形成一定的种植规模，茶树精油具有良好的广谱杀菌抑菌及保健作用，可抗病毒[2]、抗菌[3-4]、激活免疫因子[5]、抗寄生虫[6]、抗氧化防腐促进伤口愈合[7]，是一种可替代抗生素的优良天然抗菌剂，无毒无公害[8]。

分子蒸馏技术[9]（molecular distillation）是一种特殊的液——液分离技术，通过不同物质分子运动平均自由程的不同而实现分离，这和传统蒸馏技术借助沸点不同实现分离完全不同，该技术运用导热油控制温度，在一定的温度下，混合物被加热后，有一部分轻分子运动大于平均自由程后被冷凝后收集至轻组分收集瓶，重组分未被冷凝流入重组分收集瓶。从而达到分离的目的。本文主要从影响分子蒸馏的4个关键因素出发，即蒸馏温度、进样速率、刮膜器转速、蒸馏压力，以期对茶树油工业化利用、生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶树油：天津中澳嘉喜诺生物科技有限公司；松油烯-4-醇对照品：北京索莱宝科技有限公司产品；1，8-桉叶素对照品：上海麦克林生化科技有限公司产品；正己烷（色谱级）：天津市科密欧化学试剂有限公司产品；导热油（二甲基硅油）、泵油：北京四方物料有限公司。

1.2 仪器与设备

FMD-60刮膜式分子蒸馏装置：杜马斯仪器（上海）有限公司；Aligent 7890A毛细管气相色谱仪、氢火焰离子检测器（FID）：美国安捷伦公司产品；BT25S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品。

1.3 方法

本试验采取单因素研究方法，对每一馏分运用气相色谱法进行测定，得到松油烯-4-醇、1，8-桉叶素相对含量，再结合正交试验得到松油烯-4-醇、1，8-桉叶素的最佳工艺参数。

1.3.1 单因素考察[10]

根据相关资料显示，分子蒸馏法富集茶树油中特征成分与蒸馏温度、进料速率、刮膜器转速、蒸馏压力有关，因此，首先通过单因素试验来考察茶树油的富集工艺。

1.3.1.1 蒸馏温度的考察

用量筒准确量取茶树油20mL，从进料口加入，在蒸馏压力100 Pa，进料速率1 mL/min，刮膜转速360 r/min条件下，考察蒸馏温度的变化对茶树油中特征成分含量的影响。其中，温度由高温循环系统通过导热油控制，冷凝装置采用低温循环系统冷却水控制。

1.3.1.2 蒸馏压力的考察

在蒸馏温度46℃，进料速率1 mL/min，刮膜转速360 r/min条件下，考察蒸馏压力的变化对茶树油中特征组分含量的影响。

1.3.1.3 进料速率的考察

在蒸馏温度46℃，蒸馏压力100 Pa，刮膜转速360 r/min条件下，考察进料速率的变化对茶树油中特征组分含量的影响。

1.3.1.4 刮膜转速的考察

在蒸馏温度46℃，蒸馏压力100 Pa，进料速率1 mL/min条件下，考察刮膜转速的变化对茶树油中特征组分含量的影响。

1.3.2 气相色谱对特征组分的测定

1.3.2.1 气相色谱条件[11]

毛细管色谱柱Aligent DB-FFAP（30 m×0.32 mm，0.5 μm），FID 检测器，进样口温度 240℃，检测器温度240℃，进样量 1 μL，柱温从 50℃起，保持 1 min，以5℃/min的速率升至200℃，保持2 min，分流比50∶1，气体流速1.3 mL/min，恒线流速，载气为氮气。

1.3.2.2 对照品溶液的配制

精密称取1，8-桉叶素对照品 5μL（4.1mg）、松油烯-4-醇对照品 60 μL（55.75 mg），将两者置于同一 10 mL容量瓶，用正己烷定容至刻度，摇匀，得1，8-桉叶素浓度为0.41 mg/mL，松油烯-4-醇浓度为5.575 mg/mL。

1.3.2.3 供试品溶液配制

精密称取茶树油样品75 μL（71.3 mg）用正己烷定容至10 mL容量瓶；精密称取单因素条件下各馏分轻、重组分60 μL定容于10 mL容量瓶，摇匀，即得。

1.3.2.4 线性关系考察

精密吸取“1.3.2.2”项下的对照品溶液，用倍比稀释法稀释成6个浓度。分别取以上浓度对照品1 μL注入气相色谱仪，以色谱峰面积（A）为纵坐标，进样浓度（C）为横坐标绘制标准曲线。通过气相外标法得出各馏分中特征组分（1，8-桉叶素、松油烯-4-醇）的含量。

1.3.2.5 特征组分含量的测定

取“1.3.2.2”项供试品溶液 1 μL 按“1.3.2.1”项气相色谱条件进行检测，按“1.3.2.4”及公式（1）得出结论：

式中：c为特征组分的浓度，mg/mL；v为定容的体积数，mL；M为供试品的质量，mg；m为相对含量。

1.3.2.6 正交试验

在单因素试验的基础上，结合1，8-桉叶素、松油烯-4-醇蒸馏得率，选择对1，8-桉叶素、松油烯-4-醇影响较大的蒸馏温度、蒸馏压力、进料速率及刮膜转速为正交因素，设定3个水平，以特征组分的相对含量为考察指标，建立L9（34）正交试验表安排试验。

2 结果与分析

2.1 单因素对茶树油轻、重组分质量的考察结果

2.1.1 蒸馏温度对组分含量的影响

蒸馏温度对组分含量的影响见图1。

图1 蒸馏温度对组分含量的影响Fig.1 Effect of distillation temperature on component content

从图1中可以看出，轻组分呈现先增后降再增加的趋势，重组分却一直在降低。这可能因为在较低温度下，茶树油中少部分轻分子在刮膜转速作用下先溢出进入轻组分，此时温度未达到汽化温度，轻、重组分未完全分离，随着温度的升高，茶树油被汽化进入轻组分，质量迅速增加直至稳定，重组分由于轻组分的溢出出现逐渐降低的趋势。

2.1.2 蒸馏压力对组分含量的影响

蒸馏压力对组分含量的影响见图2。

图2 蒸馏压力对组分含量的影响Fig.2 Effect of distillation pressure on component content

从图2中得出，压力在40 Pa～110 Pa时，轻组分含量逐渐降低，重组分含量匀速升高，之后两者均缓慢降低，这是因为在46℃时，茶树油中大多数轻分子已进入轻相，随着蒸馏压力的升高，轻分子不能被汽化而进入轻相，只能保留在重相。

2.1.3 进料速率对组分含量的影响

进料速率对组分含量的影响见图3。

图3 进料速率对组分含量的影响Fig.3 Effect of feed rate on component content

从图3中可看出，轻组分含量呈先升高再降低后升高的趋势，重组分含量呈先缓慢降低再升高的趋势。因为在较低进料速率（小于1 mL/min）时，轻组分汽化进入轻相，而当进料速率逐渐增大时，轻组分不能完全被汽化只能再进入重相，呈现出重组分含量升高的趋势。因此，要将轻重组分很好地分离开，且易挥发的茶树油蒸馏时间过短或过长都会影响各组分的成分。

2.1.4 刮膜转速对组分含量的影响

刮膜转速对组分含量的影响见图4。

图4 刮膜转速对组分含量的影响Fig.4 Effect of scraping speed on component content

从图4中可以得出：轻组分含量出现先降低后增高的趋势，重组分含量则逐渐升高直至保持稳定。由于刮膜转速越大，分子之间的平均自由程相对增大，致使大部分分子运动小于平均自由程而进入重相，使得重组分含量逐渐升高，轻组分含量降低，当转速大于360 r/min时一部分重分子被刮膜后变成了轻分子，使得轻分子含量开始小幅度升高。

2.2 线性关系考察结果

按“1.3.2.3”中的相关内容，得出相关线性关系及气相图谱，见图5～图8。

图5 1，8-桉叶素标准曲线Fig.5 1，8-cineole standard curve

图6 松油烯-4-醇标准曲线图Fig.6 Terpinene-4-ol standard curve

由图5～图8得到：1，8-桉叶素回归方程为：A=439.21C-0.256 8，r2=0.999 98，松油烯-4-醇回归方程为：A=337.653C-3.751，r2=0.999 93。可见 1，8-桉叶素在0.012 977 mg/mL～0.410 960 mg/mL与峰面积之间具有良好的线性关系，松油烯-4-醇在0.181 451 mg/mL～5.600 60 mg/mL与峰面积之间具有良好的线性关系。

图7 茶树油对照品色谱图Fig.7 Tea tree oil reference chromatogram

图8 茶树油样品色谱图Fig.8 Tea tree oil sample chromatograms

2.3 特征成分含量测定结果

按照“1.3.2.5”的内容测得茶树油中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇的相对含量，结果见表1。

表1 茶树油中特征组分含量测定Table 1 Determination of characteristic components in Tea Tree Oil

2.4 单因素条件下各馏分中特征组分的含量

各单因素条件下轻组分及重组分中特征成分的含量，其具体结果分别见表2～表5。

从表2可以看出，轻组分中含有的1，8-桉叶素含量明显高于重组分，但松油烯-4-醇含量却相反，轻组分1，8-桉叶素相对含量随温度升高呈现先增后降的趋势，且在38℃时达到最大3.70%，但结合图1，38℃时分离得到的轻组分却很少，46℃时分离得到的轻、重组分相对较多，且轻组分中1，8-桉叶素的相对含量较多，达到3.66%；松油烯-4-醇的相对含量在重组分中随温度的升高呈现先增后降的走势，且在46℃时达到了最大56.03%。因此，选择46℃为1，8-桉叶素、松油烯-4-醇正交试验考察点。

表2 不同蒸馏温度下各组分特征成分含量Table 2 Characteristic composition of each component at different distillation temperatures

表3 不同蒸馏压力下各组分特征成分含量Table 3 Characteristic composition of each component at different distillation pressure

表4 不同进料速率下各组分特征成分含量Table 4 Characteristic composition of each component at different feed rate

从表3可以看出，轻组分中含有的1，8-桉叶素含量明显高于重组分，但松油烯-4-醇含量却相反，轻组分1，8-桉叶素相对含量随压力增加呈现先增后降的趋势，且在110 Pa时达到最大4.10%；松油烯-4-醇相对含量在重组分中随压力增加呈现先增后降的走势，且在110Pa时达到了最大55.45%。结合图2，在110Pa时分离得到的两者都较多。因此，选择110 Pa为1，8-桉叶素、松油烯-4-醇正交试验考察点。

从表4可以看出，轻组分中含有的1，8-桉叶素含量明显高于重组分，松油烯-4-醇在重组分中含量相对较高，轻组分1，8-桉叶素相对含量随进料速率增加呈现先降后增的趋势，且在2.5 mL/min时达到最大3.82%；松油烯-4-醇相对含量在重组分中随进料速率增加呈现先降后增的走势，含量相差不大，且在2.5mL/min时达到了最大55.65%。结合图3，2.5 mL/min时分离得到的两者都较多。因此，选择2.5 mL/min为松油烯-4-醇正交试验考察点。

从表5可以看出，轻组分中含有的1，8-桉叶素含量明显高于重组分，松油烯-4-醇在重组分中含量相对较高，轻组分1，8-桉叶素相对含量随刮膜转速增加呈现先降后增的趋势，且在450 r/min时达到最大3.85%；松油烯-4-醇相对含量在重组分中随刮膜转速增加呈现先增后降的走势，且在450 r/min时达到了最大56.54%，再结合图4，可知，在450 r/min时1，8-桉叶素、松油烯-4-醇两者含量相对较高。所以，选择450 r/min为正交试验考察点。

表5 不同刮膜转速下各组分特征成分含量Table 5 Characteristic composition of each component at different scratch film speed

2.5 正交试验因素水平及相关结果

按照“1.3.2.6”的内容，结合如下正交试验因素水平（表6），以轻组分中1，8-桉叶素及重组分中松油烯-4-醇相对含量为考察指标，得到如下正交试验及相关结果，见表7～表10。

表6 正交试验因素水平Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment

表7 1，8-桉叶素正交试验及相关结果Table 7 Orthogonal experiment and related results of 1，8-cineole

由表7可知，正交因素对轻组分中1，8-桉叶素的影响顺序为：D＞B＞C＞A，即刮膜转速对轻组分中1，8-桉叶素富集影响最大，其次为蒸馏压力和进料速率，蒸馏温度对1，8-桉叶素的富集影响相对较小。条件以A1B2C2D2为最佳，即蒸馏温度38℃，蒸馏压力110 Pa，进料速率2.5 mL/min，刮膜转速450 r/min。由表8可知，蒸馏压力、进料速率及刮膜转速对轻组分中1，8-桉叶素含量影响较为显著，差异具有统计学意义。蒸馏温度对1，8-桉叶素影响差异不明显。

表8 1，8-桉叶素方差分析Table 8 Variance analysis of 1，8-cineole

表9 松油烯-4-醇正交试验及相关结果Table 9 Orthogonal experiment and related results of Terpinen-4-ol

表10 松油烯-4-醇方差分析Table 10 Variance analysis of Terpinen-4-ol

由表9可知，正交因素对重组分中松油烯-4-醇的影响顺序为：A＞B＞D＞C，即蒸馏温度对重组分中松油烯-4-醇富集影响最大，其次为蒸馏压力和刮膜转速，进料速率对松油烯-4-醇的富集影响相对较小。条件以A1B2C3D2为最佳，即蒸馏温度38℃，蒸馏压力110 Pa，进料速率3 mL/min，刮膜转速450 r/min。由表10可知，蒸馏温度对重组分中松油烯-4-醇含量影响极为显著，蒸馏压力对重组分中松油烯-4-醇含量影响较为显著，差异具有统计学意义。进料速率及刮膜转速对松油烯-4-醇影响不明显。

2.6 正交试验的工艺验证

取上述试验相同的茶树油20 mL，共3份，按蒸馏温度38℃，蒸馏压力110 Pa，进料速率2.5 mL/min，刮膜转速450 r/min的工艺条件进行分离，计算轻组分中1，8-桉叶素的相对含量。同理在蒸馏温度38℃，蒸馏压力110 Pa，进料速率3 mL/min，刮膜转速450 r/min的工艺条件下计算重组分中松油烯-4-的相对含量，结果见表11。

表11 提取工艺验证表Table 11 Extraction process validation

由表11可以发现：在最优条件下，1，8-桉叶素的相对含量平均值达到5.33%，RSD值1.42%；松油烯-4-醇相对含量达到65.17%，RSD值为1.85%。

3 结论和讨论

本研究通过单因素试验分析了蒸馏温度、蒸馏压力、进料速率和刮膜转速4个因素对茶树油中1，8-桉叶素和松油烯-4-醇分离效果的影响，依据所确定的因素，设计了四因素三水平的正交试验，进一步优化了分离工艺，为深入开发利用茶树油提供理论基础。1，8-桉叶素和松油烯-4-醇是茶树油的特征组分，但由于1，8-桉叶素在茶树油中含量较低，传统的分离技术很难达到预期的效果，导致利用率相对较低。运用刮膜式分子蒸馏技术在合理的条件下能够将1，8-桉叶素和松油烯-4-醇进行富集，从而研究各自的药理活性。

本研究所用的茶树油经气相质谱检测其1，8-桉

（）（）叶素的相对含量为2.764%，松油烯-4-醇为43.416%，通过分子蒸馏技术将1，8-桉叶素相对含量提升至5.33%，松油烯-4-醇的含量提升至65.17%，富集效果明显，但仍不能满足应用需求，这或许和单因素试验中因素数值设立的不够合理有关，通过多级分子蒸馏能够进一步的提升富集程度，从而达到应用要求，但还需不断摸索。