蒋代富 朱晓英 肖雪

(遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563000)

骨质疏松是由于各种原因引起的骨量降低和骨结构恶化，导致骨组织脆性增加、病理学骨折增多。在骨的微环境中成骨细胞带来的骨形成及破骨细胞吸收在骨质疏松的发生、发展中发挥作用。既往研究表明：骨质疏松的发生、发展是一个多因素过程，常涉及多种内源性、外源性因素，均能实现骨组织的重构。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成人骨重建中成骨前体细胞主要来源，能直接参与骨质疏松的发生、发展。整合素(Integrin)α2能触发及调节细胞黏附、分化过程，是细胞同周围大分子基质环境相互作用中的重要调节因子。本研究分析Integrin α2在老龄骨质疏松BMSC成骨分化的调控机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 采用西京医院自愿捐献者的骨髓，购买Millipore生产的助转染剂、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，Invitrogen公司生产的G418、Pen-Strep，Coatar公司生产的24孔板、96孔板，Sigma公司生产的4%多聚甲醛、0.5%结晶紫、β-磷酸甘油钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，美国Gibco公司生产的α-MEM培养液、MEM-supplement100X、L-谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶、pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，瑞典PHARMACIA公司生产的Percoll分离液，HYCLONE公司生产的胎牛血清(FBS)，Roche公司生产的地塞米松、吲哚美辛，Tecknova公司生产的抗坏血酸，R&D公司生产的anti-Integrins α2，Santa Cruz公司生产的anti-β-actin、anti-osterix、anti-Runnx2，Cell Signaling公司生产的anti-磷酸化(p)、蛋白激酶B(AKT)、anti-AKT、anti-p-p38、anti-p38、anti-p-JNK、anti-JNK、anti-p-细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、anti-ERK1/2。

1.1.2主要仪器及设备 购买美国BIO-RAD公司生产的PCR仪，美国Therom Scientific公司生产的HEPA CLASS100细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司生产的1300 SERIES A2超净工作台，Leica公司生产的Leica倒置相差显微镜、荧光显微镜，美国BD公司生产的CAN/CSRC流式细胞仪。

1.2方法

1.2.1慢病毒转染BMSC效率的检测 将1×105个BMSCs接种在10 cm细胞培养板上，以含有浓度为17%的FBS的α-MEM培养基培养，在37℃的孵育箱中过夜，其含5%CO2。接种第2天将10 ml新鲜α-MEM培养基更换过来，加入20 μl 50 mg/ml助转染剂，分别按感染复数(MOI)=10、20、50、100将其和Intergrin α2一起加入对细胞进行培养，在此过程中严格依据病毒滴度，摇匀后在37℃ 含5%CO2的孵育箱中常规培养。1 d后将细胞上清去除，将等量α-MEM重新加入，在37℃ 含5%CO2的孵育箱中继续培养，荧光显微镜下对荧光进行观察。消化离心细胞后将其冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)培养基液氮中〔1〕。

1.2.2骨质疏松患者BMSC中Intergrin α2转染后高表达的检测

1.2.2.1Intergrin α2的转染高表达qPCR检测 Intergrin α2及内参引物见表1。反应体系为：12.5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ+1 μl PCR前引物+1 μl PCR后引物(终浓度为0.4 μmol/L)+2 μl cDNA模板(添加量、模板体积/总体积分别在100 ng、1/10以下)+8.5 μl无菌水=25 μl。反应条件为：在95℃的温度下进行30 s的1个循环，在95℃、60℃的温度下分别进行5 s、30 s 40个循环。采用Realtime PCR分析未转染BMSCs及转染后BMSCs Intergrin α2 mRNA水平。引物序列见表1。

1.2.2.2Intergrin α2的转染高表达Western印迹检测 制备蛋白样品，提取细胞总蛋白，然后测定蛋白含量，进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转模，免疫反应，化学发光、显影及定影反应，分析凝胶图像〔3〕。

1.2.2.3Intergrin α2转染在细胞内高表达荧光检测 对Intergrin α2表达进行细胞爬片免疫荧光检测，在带有12 mm细胞爬片的24孔板中接种转染后骨质疏松BMSCs、野生型骨质疏松BMSCs，每孔1×104，每组设立3个复孔。用普通α-MEM培养基，定期对相应的培养液进行更换，每2～3 d 1次，培养间隔为5 d，5 d后观察荧光，即将培养液吸去，PBS清洗，将3.7%多聚甲醛加入对细胞进行20 min的固定，PBS洗涤2次，每次5 min，将少量封片剂滴到载玻片上，在小心覆盖细胞爬片，荧光显微镜下对细胞染色情况进行观察并照相〔4〕。

1.2.3骨质疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表达的影响

1.2.3.1MTT分析 在96孔板中接种铺满转染与未转染细胞，在37℃、5%CO2孵育箱中孵育，第2、4、6、8天分别将5个复孔取出来，将20 μl MTT溶液(0.5%MTT)加入到每孔中，培养4 h，将孔内培养液小心吸去，将150 μl DMSO加入到每孔中，在摇床上放置，进行10 min的低速振荡，充分溶解结晶物。采用酶联免疫吸附试验检测仪在OD 490 nm处对各孔吸光值进行测量〔5〕。

1.2.3.2成骨分化与检测 在6孔板中接种转染与未转染细胞，3×103/孔，将2 ml/孔干细胞完全培养液加入到每孔中。常规培养达到70%融合，每孔加入2 ml成骨诱导培养液。定期换液，每3 d 1次，进行2～3 w诱导。1 w后对成骨特异性基因Osterix、RUNX2表达情况进行Western印迹检测。1 w、2 w、3 w后分别进行碱性磷酸酶(ALP)染色，2 w、3 w后形成钙结节，进行茜素红染色〔6〕。

1.2.4骨质疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表达影响的作用机制 成骨诱导分化后即刻、30 min、1 h、6 h分别对ERK/AKT/JNK/P38活性水平进行Western印迹检测。骨质疏松患者BMSC Intergrin α2高表达促进成骨分化受到PD98059的影响，分别以0、25、50 μmol/L浓度对未转染Intergrin α2、转染Intergrin α2的骨质疏松患者BMSC进行干预，对其ALP染色、茜素红染色受到成骨分化特异基因RUNX2的影响进行观察〔7～10〕。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1慢病毒转染BMSC效率的检测 BMSCs对Intergrin α2进行转染3 d后，荧光显微镜下可见有GFP表达，MOI=10,20,50,100时视野中分别有零星荧光、少许荧光、显著较多的荧光、最多的荧光，GFP阳性率分别为(8.3±5.3)%、(28.0±4.9)%、(34.0±6.3)%、(42.0±5.0)%。

2.2BMSC转染后Intergrin α2高表达的检测结果

2.2.1Intergrin α2转染后成功高表达目的基因qPCR检测 转染后BMSC Intergrin α2表达显著高于野生型BMSC(1.78±0.51 vs 0.25±0.08，P<0.05)。

2.2.2荧光检测Intergrin α2蛋白高表达转染后 Intergrin α2蛋白表达为43.19±4.72，转染前为14.75±3.15；转染前荧光强度为3.51±0.69，转染后为7.35±0.73，在慢病毒转染后显著提升，免疫荧光强度显著增强。

2.3骨质疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表达的影响 MTT实验结果表明，培养4 d后，细胞向增殖期进入，具有较大的生长曲线斜度，说明细胞增殖速度在转染后明显加快，骨质疏松患者BMSC Intergrin α2高表达能够为细胞增殖提供良好的前提条件。Western印迹检测结果表明，对比转染后野生型Osterix、RUNX2表达显著提升，ALP活性在第3天、1 w、2 w分别增加(43.65±4.31)、(58.01±4.52)、(60.40±4.81)。对Intergrin α2进行转染能够促进骨质疏松BMSC矿化能力的增强，2 w、3 w分别增加(40.80±4.23)、(54.80±5.77)。骨质疏松患者BMSC Intergrin α2高表达能够为成骨分化提供良好的前提条件。

2.4骨质疏松患者BMSC成骨、增殖受到Intergrin α2高表达影响的作用机制 成骨诱导后30 min，转染后ERK快速活化，1 h时显著低于未转染组(3.29±0.53 vs 6.49±1.05，P<0.05)，但是二者的AKT/JNK/P38之间的差异不显著〔(0.59±0.11)% vs (0.60±0.13)%，P>0.05〕。Intergrin α2将ERK1/2通路活化，从而为细胞增殖、分化提供了良好的前提条件。PD98059能够抑制活化ERK、转染后RUNX2，进而抑制茜素红染色所体现的成骨分化、ALP活性。

3 讨 论

随着患者年龄的增长，人体多种重要器官由于干细胞维持组织平衡能力下降，从而引起衰老相关疾病表现，亦包括骨组织，衰老能引起骨组织代谢与功能异常。经典理论认为，骨质疏松的发病是由维持骨发育动态平衡被打破引起。对于正常人而言，骨组织内含有成骨细胞与破骨细胞两类不同的成熟的骨细胞，能调节骨替代机制，从而调节骨替代机制。既往研究表明：骨重塑包括一系列细胞事件，始于募集破骨细胞前体，并融合形成成熟破骨细胞，并在骨表面发生迁移，从而吸收一定量的骨、创建一个吸收陷窝。骨吸收后能在同一解剖位置募集形成成骨细胞，从而引起矿化与薄层骨形成。BMSCs存在于成熟机体骨髓间质中，具有自我复制能力与多向分化潜能，由于其能向多种中胚层、跨胚层向内、外胚层来源的组织分化能力，如：骨、软骨、脂肪及纤维组织等多种间充质组织，被称为骨髓基质细胞干细胞。骨髓基质组织由骨髓中一类异质细胞群组成，共同构成、支持造血微环境。本研究结果表明Intergrin α2/ERK/Runx2信号通路参与了老龄骨质疏松发病，这为该病的预防与治疗提供了新的分子机制。