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lncRNA调控间充质干细胞向成骨细胞分化的研究进展

2021-12-08张瑞欣董语迪肖建辉

天津医药 2021年6期
关键词:成骨分化诱导

张瑞欣,董语迪,肖建辉△

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),又称间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs),是一种多能性基质细胞,曾被命名为成骨干细胞,其在骨病损及骨再生修复方面具有广阔的应用前景[1]。在非编码RNA中,有一类由RNA聚合酶Ⅱ产生的,长度超过200 nt的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),被认为是基因组中的“转录噪音”。近年来发现lncRNA在参与染色质重构、DNA甲基化、组蛋白修饰及作为miRNA前体等方面发挥了极其重要的作用,并且受到越来越多的关注[2]。lncRNA在MSCs成骨分化中具有转录前、转录后和翻译后水平调节的特殊作用。同时,lncRNA对骨代谢平衡有重要调控作用,可通过多种信号通路和转录因子影响MSCs成骨分化过程。本文就lncRNA调控MSCs成骨分化的最新研究进展综述如下。

1 lncRNA激活相关信号通路调节成骨分化

1.1 MAPK信号通路 MAPK通路主要包括ERK通路、JNK通路以及p38 MAPK通路,其中p38 MAPK信号通路在调节MSCs成骨分化过程中发挥重要作用。Zhang等[3]利用成骨培养基诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化,同时分析了一种被称为分化拮抗非蛋白编 码RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,DANCR)的lncRNA表达情况,结果显示,在成骨培养基诱导BMSCs成骨分化后,DANCR在BMSCs中的表达水平下降,提示DANCR可能是BMSCs成骨分化过程中的重要调节因子,进一步敲减DANCR后观察到成骨标志物COL1和Runx2的mRNA表达水平上调,而过表达DANCR导致磷酸化p38丝裂原活化(p-p38)蛋白表达水平下调,但ERK1/2、JNK蛋白表达水平无明显变化;为了进一步揭示诱导BMSCs成骨分化过程中p38蛋白与DANCR的关系,使用p38特异性抑制剂SB203580处理转染DANCR过表达载体(pcDNA3.1-DANCR)的BMSCs,发现过表达DANCR导致p38 MAPK信号通路失活,提示DANCR通过p38 MAPK信号通路调控BMSCs成骨分化。Zheng等[4]利用qPCR检测发现骨质疏松大鼠的BMSCs中的转移相关的肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)呈低水平表达,并证实敲减MALAT1可导致BMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性降低以及OCN、Runx2和COL1等成骨标志物表达水平下调,提示MALAT1可能是BMSCs成骨分化过程中的正调节因子;另外,敲减MALAT1可促进MAPK家族的ERK1/2和p38的蛋白表达水平升高,MALAT1与MAPK信号通路的关联可能为骨形成调控机制提供新的思路。有研究报道,在诱导BMSCs成骨分化过程中ALP活性增加,p-p38蛋白表达水平上调,lncRNA小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)表达水平下调,而过表达SNHG1不仅可以逆转上述作用,还能够增强神经前体细胞表达下调基因4(neural precursor cellexpressed developmentally downregulated gene 4,Nedd4)与p-p38的相互作用,破坏p-p38的蛋白稳定性,并促进p-p38泛素化;另外沉默Nedd4不仅逆转过表达SNHG1对p-p38蛋白水平的下调作用,还能增强ALP活性和提高Osterix蛋白表达水平,以上结果表明SNHG1可通过Nedd4介导p-p38泛素化负调控p38 MAPK信号通路,从而抑制BMSCs成骨分化[5]。综上,MAPK信号通路在lncRNA调控MSCs成骨分化的过程中起着重要作用。

1.2 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号通路,在成骨细胞分化和骨形成过程中起重要作用,其中β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心,在骨骼修复的早期,β-catenin不利于骨骼修复,但在骨骼修复后期,β-catenin加快成骨细胞分化并促进其骨基质的形成,因此,在此阶段增加β-catenin含量有利于骨骼修复[6]。

Shen等[7]探讨了同源异型盒基因转录反义基因间RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)能否通过调节Wnt/β-catenin信号通路参与BMSCs成骨分化,结果表明,敲减HOTAIR可增强ALP活性并上调成骨标志物Runx2的mRNA和蛋白表达水平,增加钙结节形成,而过表达HOTAIR不仅逆转上述作用,同时导致Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、cyclin D和C-myc表达水平下调,并且Wnt信号通路拮抗剂DKK1能够减弱敲减HOTAIR对BMSCs成骨分化的促进作用,表明HOTAIR抑制BMSCs成骨分化,其潜在机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。由此可见,lncRNA可与Wnt/β-catenin信号通路相互作用,在MSCs成骨分化过程中起关键调节作用。

1.3 lncRNA-miRNA调控网络 自内源竞争性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假说提出以来,已被多项研究证实[8-10]。lncRNA可以竞争性地与miRNA结合,参与miRNA对其靶基因的影响,从而调控MSCs成骨分化过程。

在骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导BMSCs成骨分化过程中,过表达lncRNA LOC100506178可上调BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表达水平,有助于BMP2诱导BMSCs成骨分化,进一步研究发现过表达mir-214-5p下调BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表达水平,并通过与BMP2的3'UTR结合而抑制BMP2的表达,从而抑制BMSC成骨分化;同时研究证实LOC100506178可直接调控mir-214-5p的表达水平,LOC100506178通过抑制mir-214-5p表达从而增强BMP2诱导的BMSCs成骨分化[11]。Yu等[12]在诱导肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)成骨分化过程中分析了钾电压门控通道亚家族Q成员1对侧链1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 opposite strand 1,KCNQ1OT1)的表达情况,发现敲减KCNQ1OT1导致ALP活性以及Runx2和Osterix蛋白表达降低,提示KCNQ1OT1是TSCs成骨分化的正调节因子,另外通过生物信息软件发现mir-138与KCNQ1OT1之间存在可能的结合位点,并通过RNA下拉实验进一步证实了KCNQ1OT1与mir-138的相互作用关系,提示在TSCs成骨分化机制中可能涉及ceRNA机制。Shang等[13]使用糖皮质激素干预大鼠BMSCs 7 d后进行了lncRNA芯片分析,发现lncRNA TCONS_00041960表达水平下调,而过表达TCONS_00041960能够上调Runx2和Osterix的mRNA和蛋白表达,提示TCONS_00041960有助于促进BMSCs成骨分化,进一步研究发现TCONS_00041960作为内源竞争性RNA可通过抑制mir-204-5p和mir-125a-3p表达,从而增强BMSCs中Runx2的表达,促进BMSCs成骨分化。Jia等[14]在诱导BMSCs成骨分化研究中,应用高通量RNA测序技术分析筛选出6个明显上调的lncRNA,即lnc-1369、lnc-554、lnc-1269、lnc-1370、RP11-348J24.8和LINC00707,并发现过表达lncRNA LINC00707可促进BMSCs中Runx2和OCN的mRNA表达水平上调,增强ALP活性以及增加钙结节形成,表明LINC00707促进BMSCs成骨分化,进一步研究发现LINC00707充当mir-370-3p的内源竞争性RNA,LINC00707通过抑制mir-370-3p表达以增强Runx2和OCN表达水平,从而促进BMSCs的成骨分化。牙周炎是一种发生在牙周组织的慢性感染性口腔疾病,牙槽骨吸收是其导致牙齿脱落的主要原因。Feng等[15]研究发现,在成骨培养基诱导牙周间充质干细胞(periodontal mesenchymal stem cells,PDLSCs)成骨分化过程中,ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平以及X失活特异转录本(X inactivate-specific transcript,XIST)表达上调,而mir-214-3p表达下调,进一步研究发现敲减XIST导致Runx2和OCN蛋白表达水平下调,表明XIST促进PDLSCs成骨分化,而过表达mir-214-3p显著降低ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平,mir-214-3p不利于PDLSCs成骨分化;通过进一步研究发现,mir-214-3p是XIST的潜在靶标,XIST通过抑制mir-214-3p表达,增强ALP、Runx2和OCN的蛋白表达水平,从而促进PDLSCs成骨分化。基于以上lncRNA与miRNA相互作用调控PDLSCs成骨分化的结果,可以考虑将lncRNAmiRNA调控网络联合MSCs的机制应用于诱导牙槽骨再生、修复受损的牙周组织,探索新的治疗方法。由此可见,lncRNA-miRNA相互作用关系在MSCs诱导成骨分化过程中起到重要的调节作用,同时对成骨相关疾病的临床诊疗具有重要意义。

2 lncRNA介导相关转录因子调节MSCs成骨分化

2.1 CXC趋化因子配体13(CXC chemokine ligand 13,CXCL13)CXCL13已被证明能影响骨关节炎患者的成骨细胞增殖[16]。同时,趋化因子受体与配体相互作用可影响MSCs的迁移,如CXCL13可与CXC趋化因子受体5(CXC chemokine receptor 5,CXCR5)特异结合,调节MSCs的迁移和分化,并且CXCL13参与MSCs成骨分化,通过下调mir-23a而促进Runx2的表达,促进BMSCs成骨分化[16-18]。

研究发现高糖(high glucose,HG)可通过降低分离培养自4~5周龄雌性C57BL/6小鼠BMSCs中ALP活性以及Runx2、OCN和OPN的蛋白表达水平从而抑制BMSCs成骨分化,并呈时间依赖性降低AK028326和CXCL13的mRNA表达水平,而过表达AK028326能够逆转HG对BMSCs成骨分化的抑制作用,过表达CXCL 13能够增强BMSCs的ALP活性;另外,在成骨细胞系MC3T3-E1细胞中,AK028326正向调节CXCL13表达,AK028326可通过上调CXCL13的表达促进BMSCs成骨分化过程[19]。因此,CXCL 13与lncRNA相互作用有助于调节BMSCs成骨分化过程,关注两者相互作用可为骨形成调控机制以及治疗骨相关疾病(如骨质疏松症)提供新的思路。

2.2Zeste增强子同源复合物2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)EZH2、Zeste基因抑制子基因12(suppressor of Zeste 12,SUZ12)和胚胎外胚层发育(embryonic ectoderm development,EED)3个核心亚基属于多梳抑制复合物2(polycomb repressive complexes 2,PRC2)。有研究发现,EZH2是MSCs成骨分化的抑制调节因子,通过敲减EZH2可上调Runx2、OPN和OCN表达水平,促进MSCs成骨分化[20]。同时,ZBTB16(zinc finger and BTB domain containing 16)、抗 黏 液 病 毒 蛋 白(myxovirus resistance,MX1)和细胞骨架相关蛋白four and half LIM domain 1(FHL1)作为EZH2的新靶点,在调节MSCs成骨分化过程中也发挥重要作用[21]。

Zhu等[22]探讨了lncRNA HoxA-AS3与EZH2相互作用对MSCs成骨分化的影响,发现敲减lncRNA HoxA-AS3可增强MSCs中ALP活性并上调成骨标志物Runx2、COL1A1、IBSP、BGLAP和SPP1的mRNA表达水平,进一步研究发现HoxA-AS3与EZH2相互作用可抑制关键成骨标志物Runx2的表达,从而抑制MSCs成骨分化。目前研究发现与EZH2相关的lncRNA包括KCNQ1OT1、GAS5、MEG3、HOTAIR和MALAT1[23],但它们在调控MSCs成骨分化中的作用机制尚不明确。因此EZH2与lncRNA参与调控MSCs成骨分化的机制有待于深入研究。

2.3 核因子(NF)-κB NF-κB是一种可调控的转录因子,在免疫反应、炎症反应和细胞分化中起核心作用[24]。NF-κB作为炎症和宿主免疫反应的主要调节因子,在调节MSCs成骨细胞的分化以及骨骼形成方面同样发挥着重要作用[25-26]。

Jin等[27]为了证实炎症因子对人脂肪源性干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)成骨分化的影响,在成骨培养基中添加外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α/白细胞介素(IL)-17,结果发现,MIR31宿主基因(MIR31HG,也称为LOC554202)的表达水平上调,并且ALP、Osterix和Runx2的mRNA表达水平以及p65磷酸化和总β-catenin蛋白表达水平降低,为了证实TNF-α/IL-17是否通过NF-κB和β-catenin途径抑制hASCs成骨分化,分别使用BAY11-7082阻断NF-κB的活化、氯化锂(LiCl)阻断β-catenin的降解,结果发现BAY11-7082和LiCl改善了TNF-α/IL-17对hASCs成骨分化的抑制作用,表明TNF-α/IL-17通过激活NF-κB和β-catenin途径抑制hASCs成骨分化,进一步研究发现,敲减MIR31HG不仅逆转TNF-α/IL-17对hASCs成骨分化的抑制作用,还导致NF-κB的靶基因IL-6、IL-7、IL-11和TNF-α表达下调以及NF-κB活性降低,另外激活的NF-κB可促进MIR31HG的表达上调,导致ALP、Runx2、Osterix和OCN的表达下调,从而抑制hASCs成骨分化,表明MIR31HG与NF-κB相互作用可调节骨形成。Zhang等[28]利用成骨培养基诱导经血间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)和脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)成骨分化,发现在MenSCs和UCMSCs中lncRNA NKILA表达水平上调,并且敲减NKILA导致MenSCs的钙结节形成减少,ALP活性降低以及Runx2、Osterix和分泌型磷酸蛋白1(secerted phosphoprotein1,SPP1)的mRNA表达水平下调,表明NKILA正向调节MenSCs成骨分化,另外通过蛋白质印迹分析和芯片证实NKILA可抑制NF-κB的转录活性,进一步研究发现NF-κB抑制剂Bay11-7082处理MenSCs导致Runx2的表达上调,提示NKILA通过NF-κB介导Runx2表达,从而促进MenSCs成骨分化。由此可见,NF-κB可参与调控MSCs成骨分化,但目前NF-κB与lncRNA调节MSCs成骨分化的机制尚未明确,有待进一步研究。

2.4 BMP BMP属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,是体内外骨形成的多能性调节因子[29],其中BMP2、BMP4和BMP9在MSCs成骨分化过程中均发挥重要作用。

Zhang等[30]发现在诱导BMSCs成骨分化过程中mir-140-5p表达呈时间依赖性下调,而lncRNA MSC反义RNA 1(MSC antisense RNA 1,MSC-AS1)和BMP2表达以及成骨标志物Runx2、OPN、OCN的mRNA表达水平呈时间依赖性上调,提示MSC-AS1可能对BMSCs成骨分化具有调节作用,进一步研究发现敲减MSC-AS1导致Runx2、OPN和OCN的mRNA表达水平下调,表明MSC-AS1促进BMSCs成骨分化,此外,MSC-AS1作为mir-140-5p的内源竞争性RNA,通过mir-140-5p调节BMP2/Smad信号通路从而促进BMSCs成骨分化。Gan等[31]利用BMP2诱导BMSCs成骨分化,发现mir-19b-3p表达上调和lncRNA H19表达下调,并且抑制mir-19b-3p导致BMSCs的细胞增殖水平和ALP活性降低,Runx2和COL1A1蛋白表达水平下调,表明mir-19b-3p是BMSCs成骨分化的正调节因子,进一步研究发现过表达H19导致mir-19b-3p表达水平下调,以及ALP活性降低和Runx2、COL1A1的蛋白表达水平下调,提示H19通过调节mir-19b-3p从而参与BMP2诱导的BMSCs成骨分化过程。目前,BMP2已经应用于骨病的临床治疗,美国食品和药物管理局(FDA)批准在脊柱融合手术、胫骨干修复和上颌窦重建手术中可使用重组人BMP-2(rhBMP-2)[32]。BMP2和BMP4在MSCs成骨分化中均表现出成骨活性,并且BMP4作为骨形成的调节剂,在MSCs成骨分化中发挥作用。Zhuang等[33]在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者中分析了成骨培养基诱导MSCs成骨分化过程中lncRNA MEG3和BMP4表达情况发现,MM患者与正常供者相比,MM-MSCs中的MEG3和BMP4表达水平下降,并且MM-MSCs和正常供者MSCs中的BMP4与MEG3表达呈正相关,在BMP4诱导的MM-MSCs成骨分化过程中,MM-MSCs中Runx2、Osterix和OCN的mRNA表达水平上调,过表达MEG3影响BMP4启动子上转录因子SOX2活性从而上调BMP4的转录水平,并上调Runx2、Osterix和OCN的mRNA表达,认为MEG3与BMP4相互作用能够增强MM-MSCs的成骨分化。另外,除BMP2和BMP4外,BMP9也被认为是诱导MSCs成骨分化的有效因子之一。Zhang等[34]发现在BMP9诱导小鼠脂肪来源MSCs成骨分化早期lncRNA Rmst表达上调,并发现敲减Rmst导致BMP9诱导的小鼠脂肪来源MSCs的OPN、OCN和COL 1A1的mRNA表达显著降低,ALP活性降低,体内骨形成数量减少,提示Rmst在BMP9诱导的小鼠脂肪来源MSCs成骨分化中起促进作用。

综上所述,lncRNA通过相关信号分子调控包括BMSCs在内多种来源MSCs成骨分化,见表1。涉及诸多信号通路和转录因子,lncRNA在MSCs成骨分化中扮演着重要的角色。目前,lncRNA在MSCs成骨分化中作用的研究仍处于起步阶段,对于lncRNA调节成骨分化的功能、生物学特性以及与信号通路的相互作用关系有待深入研究。例如:(1)环状RNA(circRNA)和lncRNA相互作用可以促进干细胞的自我更新,而circRNA-lncRNA途径参与调节MSCs成骨分化过程有待进一步探究。(2)目前还存在许多未知的靶点使各调节通路相互结合从而参与调控MSCs成骨分化过程。(3)随着对lncRNA与MSCs关系研究的深入,lncRNA可否作为标志物为疾病的诊断提供依据尚未得到明确的证实。今后希望借助更多更有效的研究手段和新方法,充分揭示lncRNA调控MSCs成骨分化的作用靶点及机制,为骨质疏松症等疾病的诊治提供新思路、新策略。

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