邓咏梅 王辉 何松霖 胡德渝 王金华

脂质体是主要由脂质分子和(或)磷脂分子组成的双分子层膜。1971年英国Sessa等[1]将脂质体用作药物载体以来，因其具有一定程度的靶向性、缓释性,能降低药物给药剂量,减轻药物毒性,提高不稳定药物的稳定性，在医药领域的研究取得了长足的进展，在医药界得到了日益广泛的关注。随着研究的发展，粒径更小的纳米脂质体(nanoliposomes)被认为是最理想的脂质体药物载体。

米诺环素制剂作为局部用药辅助治疗牙周炎已有很久的历史，其效果已得到肯定。现在应用于牙周炎辅助治疗的米诺环素剂型有：盐酸米诺环素缓释膜、2%米诺环素软膏、2%米诺环素凝胶和米诺环素可吸收性微球。米诺环素纳米脂质体辅助治疗牙周炎的研究正处于起步阶段，本实验旨在观察一种新型米诺环素制剂-以纳米脂质体为载体合成的盐酸米诺环素纳米脂质体对大鼠实验性牙周炎的治疗效果，为临床应用盐酸米诺环素纳米脂质体提供实验基础和证据。

1 材料与方法

1.1 模型建立及分组

选取无龋坏和牙周病的5周龄雌性SD大鼠110 只，体重(192.5±20.05) g(四川大学华西动物实验中心提供)。采用直径0.2 mm正畸钢丝结扎实验牙牙颈部+龈沟内接种牙龈卟啉单胞菌+喂食10%的葡萄糖水建立大鼠实验性牙周炎模型。将建模成功的78 只大鼠随机分成3 组(n=26)。阳性对照组(简称O组)采用2%盐酸米诺环素软膏治疗，实验组(简称N组)采用2%盐酸米诺环素纳米脂质体治疗，阴性对照组(简称S组)只给予0.9%生理盐水。

1.2 给药及观察时间

每组每周牙周袋内给药1 次，连续56 d。动物饲养在24 ℃恒温实验室。分别在给药7、28、56 d后检查实验大鼠的牙龈指数(gingival Index，GI)、探诊深度(probing depth，PD)，并于各观察期每组分别处死6 只进行组织学观察。在实验过程中，给药与指标测量由2 个不同实验人员独立完成。

1.3 观察指标

牙龈指数(gingival index，GI)：采用Loe与Silness 1967 年修订的检查方法[2]探诊深度(probing depth，PD)：测量牙龈缘至牙周袋底或龈沟底的深度。检查左上颌第一磨牙腭侧近中，腭侧正中，腭侧远中，求取平均值。

组织学观察：选择包埋较好的3 个蜡块，每个蜡块选取1 张包含3 个磨牙在内的组织切片，在40×0.65显微镜下连续摄取4 张矩形数码照片，手工挑出单核细胞及破骨细胞并计数。其它内容：牙龈上皮位置，新纤维，新骨的形成。

1.4 统计学分析

采用Epidata 3.1录入数据，SPSS 19.0进行统计分析。主要运用的统计方法有：统计描述、方差分析以及T检验等，检验水准取0.05。

2 结 果

2.1 大鼠实验性牙周炎模型的建立

建模21 d后，测得84 只实验大鼠GI和PD为(2.550±0.594)、(1.593±0.177) mm。处死6 只大鼠进行组织学观察，可见左上颌第一磨牙腭侧牙龈重度红肿，上皮与牙面分离，第一、二磨牙间牙龈乳头红肿，个别可见溃疡出现。结合上皮处有溃疡形成,上皮与牙面分离，上皮根向增殖，上皮病变以破坏为主，袋内上皮糜烂，袋内可见细菌团块；上皮下及牙周组织中单核细胞浸润明显，牙周纤维破坏明显；牙槽骨吸收明显，可见较多的破骨细胞及陷窝(图 1)。说明大鼠实验性牙周炎模型建立成功。78 只SD大鼠体重(172.5±10.22) g。

2.2 视觉指标

给药7 d后，检查实验大鼠的牙龈指数，N、O组略低于基线水平，S组略高于基线水平，但各组间差异无统计学意义(F=0.137,P=0.872)，且N组与O组和S组相比亦无明显差异(t=0.263，P=0.794；t=0.525，P=0.603)。实验大鼠的探诊深度，N、O组也略低于基线水平，S组略高于基线水平，但各组间差异无统计学意义(F=0.137,P=0.872)，且N组与O组和S组相比亦无明显差异(t=0.835，P=0.409；t=1.622，P=0.113)(表 1)。

表 1 实验各时期牙周指数 (n=6)

注：①与基线比较，P<0.05；②与S组比，P<0.05；③与O组比，P<0.05

给药28 d后，已能观察到2%盐酸米诺环素纳米脂质体对治疗大鼠实验性牙周炎的作用。

给药56 d后，2%盐酸米诺环素纳米脂质体和2%盐酸米诺环素软膏对治疗大鼠实验性牙周炎都有效，而2%盐酸米诺环素纳米脂质体效果更好。

2.3 组织学指标

给药7 d后，3 组大鼠牙周炎均无明显变化。3 组牙龈上皮位置变化不明显，牙槽骨未见明显变化(图 1)，但实验组和阳性对照组单核细胞和破骨细胞亦无明显变化(表 2)。

给药28 d后，阳性对照组牙周炎改善不明显，牙龈上皮的位置向冠方移动，未见明显的新纤维形成，牙槽嵴顶未见继续吸收；实验组牙周炎开始好转，牙龈上皮的位置向冠方移动幅度较大，可见少量新纤维生成，已吸收的牙槽骨未见新骨形成；阴性对照组牙周炎加重，牙龈上皮继续根方增殖，牙槽嵴顶吸收至根尖1/3(图 1)。表 2显示给药28d后2%盐酸米诺环素纳米脂质体和2%盐酸米诺环素软膏均使牙周组织中单核细胞和破骨细胞减少，表明对治疗大鼠实验性牙周炎都有作用。

图 1 组织学观察 (HE, ×100)

表 2 实验各时期单核细胞与破骨细胞比较 (n=6)

注：①与基线比较，P<0.05；②与S组比，P<0.05 ；③与O组比，P<0.05

给药56 d后，阳性对照组牙周炎开始好转，牙龈上皮接近于正常位置，可以看见新纤维的形成，已吸收的牙槽骨未见到明显的新骨形成；实验组牙周炎明显好转，牙龈上皮基本恢复正常，可见较多新纤维的形成，已吸收的牙槽嵴顶可见新生牙槽骨；阴性对照组牙周炎进一步加重牙龈上皮继续根方增殖，纤维紊乱，断裂，牙槽嵴顶继续吸收，到根尖处(图 1)。且实验组单核细胞和破骨细胞数比阳性对照组更低(t=6.882，P=0.000；t=5.997，P=0.000)(表 2)。说明给药56 d后2%盐酸米诺环素纳米脂质体治疗大鼠实验性牙周炎的效果比2%盐酸米诺环素软膏更好。

3 讨 论

牙周病是由龈上菌斑引起的细菌感染而导致的局部炎性反应[3]，牙周致病菌分泌有害物质和酶将直接或间接触发宿主产生免疫反应而引起自身损害[4]。新兴的牙周病治疗观念是阻断造成组织破坏的宿主反应及细菌的有害作用，四环素类药物被证实有抗菌及调节宿主免疫反应的作用。

本实验中，实验组和阳性对照组均观察到GI、PD、单核细胞、破骨细胞显著降低。与阴性对照组比，差异具统计学意义(P<0.05)，组织学观察可见新纤维，新骨的形成，而阴性对照组随着时间延长牙周炎进一步加重，这是因为两组实验药物的有效成分均为盐酸米诺环素，其对牙周炎有治疗作用，而阴性对照组药物中无对牙周炎有治疗作用的成分。

盐酸米诺环素作为一种合成的四环素，其具有较强的抗菌作用，能明显地抑制致牙周病细菌，还可诱导成熟破骨细胞的凋亡，抑制破骨细胞的生成，促进成骨。Gomes等[5]的外实验研究发现，人外周血单核细胞培养基中长期使用250 ng/ml的盐酸米诺环素可以显著抑制破骨细胞的形成。5 μg/ml盐酸米诺环素在24 h内也能够明显诱导成熟20 d以上破骨细胞的凋亡。Somerman等[6]研究发现20 mg/ml的盐酸米诺环素可以增强牙龈成纤维细胞附着于塑料界面。Rompen等[7-8]观察到用2.5%盐酸米诺环素处理牙本质界面可以增强牙龈成纤维细胞的附着。覆盖伤口的细胞的迁移是牙周愈合中牙周组织再生的另一重要影响因素。盐酸米诺环素可以诱导细胞质的丝状伪足伸展，增强细胞的迁移。Babich等[9]实验显示：50 mg/ml的米诺环素可以使S-G细胞迁移至牙周愈合。

脂质体是主要由脂质分子和磷脂分子组成的封闭的连续的双层结构[10-11]，与细胞膜十分相似。脂质体具有淋巴系统趋向性，组织靶向性，易被吞噬细胞摄取，提高药物疗效，减少药物用量和毒副作用等优点，可作为抗生素等药物的载体应用于临床[12]。纳米脂质体,即小单室脂质体,是粒径为小于100 nm的一类单室脂质体。其作为药物载体，具有脂质体同样的优点；同时由于其生物相容性好，药物可迅速的从牙周袋内吸收至牙龈组织中及深部牙周感染组织[13]。

本实验中,阳性对照组药物为2%盐酸米诺环素软膏[14]，是缓释抗菌药物，虽能大大提高牙周袋内盐酸米诺环素的浓度，但由于缓释剂中药物释放速度不稳定，通常在其置入袋内2～3 d内释放出80%～90%的盐酸米诺环素，随后释放速度变慢，药物浓度明显下降，致使牙周袋内药物浓度波动较大，不利于感染的控制。而试验组药物是以纳米脂质体为载体，不仅具有上述的优点，同时其属于控释制剂，可使盐酸米诺环素在预定时间内自动按某一速度从剂型中以恒定的速度释放于牙周袋内，使牙周袋内的药物浓度较长时间恒定地维持在有效浓度范围内，延长盐酸米诺环素纳米脂质体的有效作用时间。因此，与阳性对照组相比，实验组药物更容易到达已经破坏的牙周袋深部，且在牙周袋内的药物浓度更高，有效作用时间更长。所以，实验组在给药28 d后就可以观察到GI,PD，单核细胞数目，破骨细胞数目明显降低，且能见到少量新纤维的形成，说明被破坏的牙周组织已经开始修复。而阳性对照组牙周炎仅单核细胞数目，破骨细胞数目明显降低，却不能看见新纤维形成，牙周组织未出现明显的修复。由于药物持续作用，给药56 d后，实验组组GI、PD继续显著降低，只见到少许单核细胞，偶见破骨细胞，见到新骨形成，大量新纤维的形成，说明已经破坏的牙周组织大部分已得到修复。而阳性对照组虽然GI、PD、单核细胞、破骨细胞数目明显降低，但降低幅度小于实验组，仅见少量新纤维的形成，未见到明显的新骨形成，组织修复程度明显弱于实验组,与徐燕等[15]研究结果相符。

在本实验中，由于SD大鼠牙周袋较小，未行牙周洁刮治及根面平整术，若在临床试验中配合洁刮治及根面平整术，盐酸米诺环素纳米脂质体辅助治疗牙周炎的效果可能更加显著。

牙龈的炎症和牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改变。牙龈指数可以反映牙龈炎症的程度，客观简便，广泛用于临床疗效评价；牙周探诊是牙周病最重要的检查方法，其中探诊深度可以反映牙周袋深度的变化，袋深者炎症较重。而组织学观察提供结果观察的金标准。本实验中采用GI、PD及组织学观察共同观察药物的治疗效果，得到的实验结果可信度高。在为期2 月的实验中，2%盐酸米诺环素纳米脂质体及2%盐酸米诺环素软膏均能有效改善大鼠实验性牙周炎，且前者的治疗效果优于后者，具有临床应用前景。