林 立， 李仁勇， 王琳琳， 邱 云

(1．国家食品质量安全监督检验中心，北京100094;2．中科谱研(北京)科技有限公司，北京100027)

牛肝菌类是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的统称，大部分品种可食用。其中以美味牛肝菌最为著名，其味道鲜美，营养丰富，成为世界闻名的食用菌之一，在欧洲更被称为“王者牛肝菌”。我国云南、四川、西藏、贵州等多地区盛产美味牛肝菌［1］，其已成为我国出口量最大的野生食用牛肝菌品种。牛肝菌含有丰富的营养成分，如多糖、甾体、萜类、多酚、氨基酸和生物碱等［2，3］，其中常见的生物碱主要有胆碱和腺嘌呤等。胆碱是正常代谢不可缺少的物质，具有促进脑发育和提高记忆力等作用。另外，牛肝菌还含有丰富的氨基酸，其中精氨酸和鸟氨酸在细菌氨基酸脱羧酶作用下脱羧生成腐胺，赖氨酸脱羧生成尸胺。腐胺、尸胺气味难闻，影响食品风味和品质，还可能与亚硝酸盐形成致癌的亚硝胺［4］，腐胺还可导致尼古丁的生成［5］。

目前对于食品中胆碱的研究常用酶比色法［6］和雷氏盐比色法［7］。比色法存在操作繁琐、干扰因素多等问题。生物胺检测有简便、快速的酶生物传感器法［8］，但所用特异性酶成本昂贵不利于推广。液相色谱法［9，10］是目前检测胆碱和生物胺最常用的方法，通常采用带有阳离子交换基团的硅胶色谱柱，因胆碱、腐胺和尸胺分子本身缺乏发色基团，需要使用通用型检测器(如蒸发光散射检测器)。此类带有阳离子交换基团的硅胶色谱柱对pH耐受范围窄，柱寿命相对较短，且蒸发光散射检测器的灵敏度相对较低，稳定性较差。若要提高检测灵敏度，需要采用柱前或柱后衍生技术，以紫外［11］或荧光检测器［12，13］进行检测，但方法相对繁琐。离子色谱法［14－17］则使用pH耐受极强的聚合物阳离子交换柱，无需复杂前处理和衍生，对于胆碱和大部分生物胺可直接使用电导检测［14－16］，灵敏度远高于蒸发光散射检测器和荧光检测器。柱后加碱安培法则可检测几乎全部常见生物胺［17］。

关于牛肝菌中胆碱、腐胺和尸胺含量的测定，尚未见到相关研究报道。本研究使用离子色谱法同时检测了美味牛肝菌样品中的胆碱、腐胺和尸胺，用高容量阳离子交换色谱柱进行分离，用抑制型电导检测。

1 实验部分

1．1 仪器和试剂

ICS-3000型离子色谱仪、IonPac CG17保护柱(50 mm×4 mm)、IonPac CS17分析柱(250 mm×4 mm)、OnGuardⅡ RP固相萃取柱(1 mL)和CSRS 300抑制器(4 mm)均购于美国Dionex公司;Milli Q超纯水机(美国Millipore公司);0.22 μm微孔尼龙膜(天津富集公司)。甲基磺酸(纯度99%，美国Acros Organics公司);氯化胆碱(纯度99.98%，美国Sigma-Aldrich公司);腐胺(纯度99%)和尸胺(纯度98%)均购自德国 Dr．Ehrenstorfer公司;美味牛肝菌干片样品采集自市场。

1．2 标准贮备液的配制

准确称取适量氯化胆碱、腐胺、尸胺标准品，分别用水溶解并配制成质量浓度为1 g/L的标准贮备液，于4℃保存。

准确移取5.00 mL胆碱贮备液、2.50 mL腐胺贮备液和2.50 mL尸胺贮备液到25 mL容量瓶中，以超纯水定容至刻度，摇匀配制得到200 mg/L胆碱、100 mg/L腐胺和100 mg/L尸胺混合标准溶液，于4℃保存。

1．3 淋洗液配制

称取0.671 8 g甲基磺酸，以超纯水稀释并定容到1 L，配制7 mmol/L甲基磺酸淋洗液。此溶液也用于样品提取。

1．4 前处理方法

称取粉碎后的美味牛肝菌样品0.200 g，加入100 mL 7 mmol/L甲基磺酸溶液，在摇床上以200 r/min的速度振荡2 h。经3 000 r/min的速度离心，取上清液，通过0.22 μm 尼龙滤膜和OnGuardⅡRP固相萃取柱(2.5 mL)，弃去初始6 mL流出液后收集2 mL流出液，直接进样分析。

1．5 测定条件

色谱柱:IonPac CS17(250 mm×4 mm)分析柱，IonPac CG17(50 mm×4 mm)保护柱;柱温:30℃;进样体积:25 μL;使用7 mmol/L甲基磺酸等度淋洗;流速:1.00 mL/min;检测方式:抑制型电导，CSRS 300抑制器(4 mm)，抑制电流为15 mA，自循环模式。

2 结果与讨论

2．1 色谱柱、淋洗液和检测方式的选择

常用抑制型阳离子交换分离柱有IonPac CS12A、CS16和CS17。其中CS12A属于中低疏水的色谱柱，CS16均属于中等疏水的色谱柱，而CS17则属于极低疏水色谱柱。虽然3者均为高容量色谱柱(具体性能比较见表1)，但其中CS17柱容量相对较低。胆碱属于单胺，保留相对较弱，在3种色谱柱均能实现较好分离。而腐胺和尸胺均属于二胺，在色谱柱上保留行为非常强。因此若需保证胆碱、腐胺和尸胺同时测定，应尽可能选择疏水性低和柱容量相对较低的色谱柱，CS17是最佳色谱柱选择。

表1 常见阳离子交换色谱柱性能比较Table 1 Comparison of the performance of the common cation exchange chromatography columns

本方法研究了甲烷磺酸浓度对样品分析的影响，以确定最佳的淋洗液条件。观察实际样品分离谱图可发现，在腐胺的色谱峰前存在一个非常相近的未知峰，因此选择该峰与腐胺的分离度作为评价分析方法的主要指标。如图1所示，当甲烷磺酸的浓度为10 mmol/L时，该未知峰与腐胺分离度仅能达到1.2，不能实现基线分离，从而影响结果准确性。随着甲烷磺酸浓度逐步降低至8 mmol/L时，二者的分离度可达到1.6。继续研究了淋洗液浓度为7和6 mmol/L时的分离情况，分离度进一步可提高到1.8和1.9。但由试验谱图可见，随着甲烷磺酸浓度的逐渐降低，分析时间不断增加，意味着分析效率的逐渐降低。综合考虑分离度、分析时间以及方法的耐用性，选择7 mmol/L甲基磺酸溶液作为最优和最终分离条件。

图1 甲基磺酸浓度对分离的影响Fig．1 Effects of the concentration of methanesulfonic acid(MSA)on the separation

由于胆碱、腐胺和尸胺的酸电离常数的负对数pKa均大于10，即碱电离常数的负对数pKb小于4，表明这3种有机碱性化合物为弱碱性(pKb小于5)，可发生电离，因而在电导检测器上会有响应。牛肝菌样品中一般含有较高浓度的氨基酸，因其具有氨基结构，在酸性淋洗液下可在阳离子交换色谱柱上保留，且在电导检测器上也会有响应。但因其具有羧基，若采用阳离子抑制器，氨基酸会吸附在抑制器的阴离子交换材料上，在电导检测器上不出峰，可避免共存氨基酸对胆碱、腐胺和尸胺的干扰。此外，与传统非抑制法相比，抑制法的淋洗液经过抑制后，背景电导和噪音降低，检测灵敏度也得到提高。因此综合考虑上述原因，选择抑制型电导法检测更为适合。

2．2 样品共存干扰及前处理方法的选择

美味牛肝菌中可能在阳离子交换柱上保留并干扰测定的组分主要有氨基酸、腺嘌呤、常见碱金属和碱土金属、铵和乙酰胆碱等。配制可能共存物质混合标准溶液，进样后发现锂、钠、铵、钾、镁、钙、乙酰胆碱与胆碱、腐胺和尸胺的分离度均达到2以上。未观察到常见氨基酸和腺嘌呤的明显色谱峰，表明其对这3种待测物质的测定也不存在干扰。分离谱图见图2。

图2 胆碱、腐胺、尸胺与可能共存物质的分离Fig．2 Separation of choline，putrescine，cadaverine and the possible coexisting substances

样品提取液包含有机大分子物质，为避免污染色谱柱，需在进样前预先净化。目前可用于吸附有机大分子物质的固相萃取柱主要有反相柱(多孔二乙烯基苯树脂)和石墨化炭黑柱，但初步试验发现，使用这两种类型固相萃取柱净化提取样品时，腐胺和尸胺的回收率会存在20%以上的损失。尝试了不同浓度的甲基磺酸提取溶液对测定结果的影响。发现以RP柱净化样品时，若样品中存在5到20 mmol/L甲基磺酸，胆碱、腐胺和尸胺的回收率为97.8%～100.8%(见表2)。因此可直接选择 7 mmol/L甲基磺酸淋洗液作为提取溶液。而在石墨化炭黑柱上，即使使用甲基磺酸也无法改善腐胺和尸胺的低回收率问题。

表2 提取溶液中MSA的浓度对分析物回收率的影响Table 2 Effect of the MSA concentrations in the extraction solution on the recoveries of the analytes

2．3 标准曲线和方法检出限

胆碱、腐胺和尸胺在0.01～10 mg/L范围内均可以获得良好的线性，相关系数(R2)分别为0.999 9、0.999 7和0.999 9。胆碱、腐胺和尸胺的工作曲线结果见表3。由S/N=3估算方法检出限:胆碱为0.002 mg/L，腐胺为0.002 mg/L，尸胺为0.003 mg/L。对应于实际样品中的检出限分别是:胆碱为1.0 mg/kg，腐胺为1.0 mg/kg，尸胺为1.5 mg/kg。

表3 胆碱、腐胺和尸胺的线性范围、线性方程和线性相关系数Table 3 Linear ranges，linear equations and correlation coefficients(R2) of choline，putrescine and cadaverine

2．4 实际样品测定结果、加标回收率和精密度

通过对实际样品进行加标回收试验考察方法的准确性。先称取约0.2 g样品到100 mL容量瓶中，分别加入胆碱、腐胺和尸胺混合标准溶液0.500、1.000和2.000 mL，混匀后用7 mmol/L甲基磺酸溶液定容到刻度，用1.4节方法处理后进行检测。加标样品的色谱图见图3，具体测定结果见表4。加标回收率为 91.6%～100.2%，相对标准偏差为0.21%～2.11%。结果表明，离子色谱法对胆碱、腐胺和尸胺的测定具有良好的可靠性。

对附近市场中购买到的美味牛肝菌样品进行测定，结果显示样品中可检测到胆碱和腐胺，而尸胺则未被检测到，样品色谱图见图3。

图3 美味牛肝菌样品提取液色谱图Fig．3 Chromatograms of the boletus edulis extract

表4 美味牛肝菌样品的加标回收率、相对标准偏差和含量(n=3)Table 4 Spiked recoveries，RSDs and contents of the boletus edulis sample(n=3)

3 结论

建立了美味牛肝菌中胆碱、腐胺和尸胺的离子色谱分析方法，利用亲水性阳离子交换色谱柱Ion-Pac CS17进行分离，使用抑制型电导检测器测定了牛肝菌样品中的3种有机碱。方法操作简单，无需衍生，抗干扰能力强，灵敏度高，适用于牛肝菌样品的分析，可用于相关制品的生产质量控制，为保证食品安全提供了保障。此方法还可用于牛肝菌样品中钠、钾、镁、钙、乙酰胆碱等的测定，有待进一步研究。