崔丽丽， 闫梅霞， 朴向民， 逄世峰， 王英平

(中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112)

1980年世界卫生组织将农药残留测定单独列为检测项目［1］，近年来中药材农药残留问题已引起国内外普遍关注。特别是2013年绿色和平组织发布的《药中药:中药材农药污染调查报告》中报道，对来自中国的菊花、枸杞、金银花等常用中药材抽样检测，样品检测出农药残留，部分样品检测到剧毒高毒农药，引起了全球关注［2，3］。我国自1982年提出农药登记制度至今，在人工种植的上百种中药材中只有人参和三七有农药登记［4］。2013年，农业部评审通过了嘧菌环胺、苯醚甲环唑、丙环唑、异菌脲、嘧菌酯、醚菌酯等14种人参(panax ginseng)生产用农药，结束了我国人参用药短缺、农药使用不合理、缺乏合法登记的历史［5］。据本实验室统计，到2017年已完成杀菌剂、植物生长调剂、杀虫剂3大类18种农药24个剂型的登记工作。GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定，人参中苯醚甲环唑和嘧菌酯的残留限量值分别为0.5和1.0 mg/kg。其他已登记农药随着国际贸易的需要和种植者农药使用情况会逐步规定其残留量限定值。近年来，韩国、日本等国家也大幅度调整中药材中各类农药最大残留限量值，韩国的新鲜人参、干人参和红人参里规定了常用农药甲霜灵、嘧菌酯、嘧菌环胺、乙霉威、咯菌腈最大残留限量分别为0.5、0.5、2.0、0.3 和 0.5 mg/kg，禁用农药滴滴涕(DDT，包括滴滴滴(DDD)和滴滴伊(DDE))和六六六(BHC)限量均为0.05 mg/kg。日本肯定列表中其他药草项下苯醚甲环唑、异菌脲、腐霉利、丙环唑和二嗪磷限量分别为 0.2、20、5、0.05和 0.2 mg/kg，六氯苯和七氯这样残效期长的农药限量低至0.01和0.03 mg/kg。国内外市场的变化对我国人参种植中农药合理使用和农药残留限量及检测技术都提出了新的挑战。有机氯农药属于神经及实质脏器毒物，可致癌，且半衰期长，性质稳定不易分解，能长期在水体、土壤和生物体内储存，严重危害人体健康［6］。虽然我国［6］于 1983年4月1日已经禁止使用有机氯农药，但是在土壤中的历史积累严重。何苗［7］、彭非［8］调查分析发现五氯硝基苯、六氯代苯、DDT、BHC和氯丹普遍存在人参及其栽培土壤中。根据我国人参登记农药和有机氯类积累实际情况及进出口国农药残留限量，本文确定了20种农药作为检测对象，建立了简单快速的检测方法。

人参中农药检测的提取方法有超声法［9，10］、振荡法［11，12］、均质法［13］、固相萃取法［14，15］、索氏提取法［10，16］及超临界流体萃取法［17］;净化方法有浓硫酸磺化法［10］、液液萃取(LLE) 法［9］、固相萃取净化(SPE)法［15，18］、凝胶渗透色谱净化(GPC) 法［14］及QuEChERS法［19］;常用分析技术有气相色谱(GC)法［9］、高效液相色谱(HPLC) 法［15，20，21］及串联质谱法［13，22－24］。QuEChERS 法是基于分散固相萃取发展起来的一种集萃取和净化为一体的新型前处理方法，已成为美国分析化学家协会标准方法(AOAC 2007.01)和欧洲标准化委员会标准方法(EN 15662)，与SPE和LLE等方法相比，能够有效缩短前处理时间，提高检测效率，有机溶剂用量显著降低。QuEChERS法已广泛用于食品、蔬菜等农药残留检测中［25－29］，除此之外还用于食品中兽药、抗生素［28，29］、真菌毒素［30］检测中。QuEChERS 法在人参农药残留检测中也有报道，梁利鹏等［31］建立了检测人参中33种有机氯和菊酯类农药残留的QuEChERS-气相色谱-质谱法，赖青海等［32］利用QuEChERS-气相色谱-质谱法测定了人参提取物中的有机氯、有机磷和常用杀菌剂嘧菌酯、精甲霜灵、恶霜灵等25种农药。因此，加强人参中农药使用登记工作，提高农药残留检测技术和农药合理使用技术，这不仅有利于中药材产品的出口贸易，更关乎我国的食品安全和环境保护。本研究主要是针对人参中已登记的常用杀菌剂及残留期长的有机氯类农药，利用QuEChERS方法原理建立集萃取和净化为一体的新型前处理方法，结合GC-MS检测系统，用于人参中农药多种残留快速提取检测。该方法不仅能够有效缩短前处理时间，提高检测效率，而且有机溶剂用量显著降低，使得农药残留分析更环保，同时最大限度地保障了检测人员的身体健康。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)，天平(感量分别为0.001和0.000 1 g，瑞士梅特勒国际有限公司)，TGL-16M高速离心机(湖南湘仪离心机有限公司)，T25均质器(德国IKA公司)，Vortex 2涡旋混合器(德国IKA公司)。

乙腈、丙酮、正己烷(色谱纯，美国 Fisher公司);0.22 μm有机相微孔滤膜(北京迪马科技有限公司);净化试剂盒64501(50 mg PSA(N-丙基乙二胺)/150 mg MgSO4)，64504(150 mg PSA/900 mg MgSO4)，64512(150 mg PSA/45 mg Carb/900 mg MgSO4)，64565(300 mg PSA/300 mg C18/90 mg Carb/900 mg MgSO4/300 mg silica)(北京迪马科技有限公司);水为GB/T 6682规定的一级水。农药标准物质:α-BHC(纯度99.5%，CAS No．319-84-6)，β-BHC(纯度 99.5%，CAS No．319-85-7)，γ-BHC 即林丹(纯度99.5%，CAS No．58－89－9)，δ-BHC(纯度98.1%，CAS No．319-84-6)，六氯苯(纯度 99.5%，CAS No．118-74-1)，p，p'-DDD(纯度98.1%，CASNo．72-54-8)， o，p'-DDT(纯 度99.5%，CAS No．789-02-6)，p，p'-DDT(纯 度98.9%，CAS No．50-29-3)，p，p'-DDE(纯度99.5%，CAS No．72-55-9)，嘧菌环胺(纯度100%，CAS No．121552-61-2)，腐霉利(纯度100%，CAS No．32809-16-8)，五氯硝基苯(纯度 99.5%，CAS No．82-68-8)，七氯(纯度99%，CAS No．76-44-8)，二嗪磷(纯度100%，CAS No．333-41-5)，醚菌酯(纯度 99%，CAS No．143390-89-0)，丙环唑(纯度 99.5%，CAS No．60207-90-1)，嘧菌酯(纯度 99.5%，CAS No．131860-33-8)，乙霉威 (纯度 99.5%，CAS No．87130-20-9)，苯醚甲环唑(纯度 99.5%，CAS No．119446-68-3)，均购于国家标准物质中心。

供试样品鲜人参经40℃干燥后取不少于200 g试样，置于高速粉碎机中粉碎，过100目筛3～5次，充分混匀，装入聚乙烯塑料袋中保存。

1．2 标准溶液配制

精密称取50 mg各标准物质，用乙腈溶解，配制成质量浓度为 500 mg/L的储备液，储存于－20℃。精密吸取适量的储备液于25 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成相应浓度的工作液。

1．3 样品液制备

称取1.0 g已粉碎均匀的试样，加入10 mL纯水浸泡30 min，加入20 mL乙腈，高速(3 000 r/min)涡旋振荡提取2min。加入6 g NaCl，混匀1 min，以5 000 r/min的速度离心5 min。取上清液4 mL，加入净化试剂盒64504，涡旋1 min，混匀，以5 000 r/min的速度离心5 min，取上清液上机检测。

1．4 色谱质谱条件

离子源为电子轰击源(EI);选择离子监测(SIM)模式。进样体积为1 μL;进样方式为脉冲不分流进样。色谱柱为HP-5毛细管柱，30 m×0.25 mm(内径)×0.25 μm(膜厚)。色谱柱升温程序:初始柱温为120℃，保持1 min;以10℃/min升到260℃，保持10 min。进样口温度为250℃;检测器温度为280℃;载气为纯度≥99.999%的氦气，流速为1.0 mL/min;尾吹气流量为29 mL/min;脉冲压为1.722 5×105Pa;溶剂延迟时间为10 min;电离能量为70 eV。

1．5 净化试剂盒数据分析

数据采用SPSS17.0进行单因素方差分析，Duncan检验;用Excel 2006进行图像处理。

2 结果与讨论

2．1 色谱质谱条件优化

选择对弱极性化合物分离较好的HP-5毛细管柱色谱柱，通过全扫描模式扫描，确定每种农药的保留时间，选择定性定量离子，建立SIM离子监测方法，每种农药选择1个定量离子、2个定性离子，按照保留时间顺序分段检测。每种农药的保留时间、定量离子、定性离子见表1。

表1 20种农药的质谱参数Table 1 Mass parameters for the 20 pesticides

2．2 提取方法优化

2．2．1 提取溶剂体积

QuEChERS法中常用的提取溶剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，乙腈最适宜于萃取极性范围较宽的多种农药，且萃出物中杂质含量较低［33］，是目前使用最广泛的提取溶剂。本试验根据农药的溶解性和稳定性，同时参照 AOAC(Association of OfficialAnalyticalChemists)［34］和 European Standard EN15662［35］的 QuEChERS 方法，选择乙腈作为提取溶剂。通过添加0.1 mg/kg水平的回收率试验，比较了10、20和30 mL乙腈的提取效率。试验结果(见表2)表明，提取溶剂体积对α-BHC、五氯硝基苯等半数农药的回收率具有显著性差异(p＜0.05)，10 mL乙腈提取的添加回收率最高，提取效果好于20 mL和30 mL。

2．2．2 振荡时间

振荡时间对提取样品非常重要，它与样品中农药含量和样品本身的理化特性有关，为了确定在一定时间内样品中农药是否已被完全提取，本试验设振荡时间为2、3和4 min，重复3次，试验结果如表3所示，经方差分析发现，提取时振荡时间对 γ-BHC、p，p'-DDT、乙霉威、丙环唑和嘧菌酯5种农药回收率有显著性影响(p＜0.05)，对其他农药回收率影响不显著。γ-BHC、乙霉威、丙环唑和嘧菌酯的回收率在振荡时间为4 min时高于2和3 min时的回收率，所以确定4 min为最佳振荡时间。

2．3 净化剂

QuEChERS方法中常用的净化剂有PSA、C18、Carb、无水 MgSO4等［36］。进行农药残留检测时，净化效果极大地影响检测仪器和检测结果，本试验考察了64501、64504、64512和64565这4种净化试剂盒对农药回收率的影响(见图1)。结果表明，随着PSA和MgSO4量的提高，农药回收率提高。64504回收率最高，20种农药的回收率为 63.82%～117.97%。净化剂中含有的Carb、silica和C18会吸附部分农药，导致回收率降低。使用64565净化后，回收率最差，嘧菌环胺、六氯苯、丙环唑峰2、乙霉威、五氯硝基苯等农药回收率分别低至17.4%、26.3%、49.9%、58.8%、62.4%。综上，本试验选择64504即150 mg PSA/900 mg MgSO4作净化剂。

2．4 方法学验证

2．4．1 标准曲线与检出限

分别精密吸取各农药标准物质储备液，配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 和 5.0 mg/L的系列标准工作液，按本方法在SIM模式下进行测试，以峰面积(y)为纵坐标、以质量浓度(x，mg/L)为横坐标作标准曲线，得到各农药的线性回归方程和相关系数。结果表明，20种农药线性关系良好(见表4)。

表2 不同体积乙腈提取人参中农药的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of pesticides extracted from panax ginseng by different volumes of acetonitrile(n=3)

表3 不同振荡时间对人参中农药提取的影响(n=3)Table 3 Effects of different oscillation time on the pesticide extraction from panax ginseng(n=3)

图1 不同净化试剂盒处理后的人参中农药回收率Fig．1 Recoveries of the pesticides from panax ginseng by different purification kits

首先向空白样品中添加混合标准物质液，质量浓度为0.02 mg/kg，经过已确定的方法进行前处理及GC-MS检测，以信噪比S/N=3确定检出限、S/N=10确定定量限。

2．4．2 回收率

向样品中准确加入一定量(0.02、0.05和0.1 mg/kg)的混合标准溶液，每个水平设定3个平行样和1个对照样，按最优条件进行测定，计算平均加标回收率和3次测定的相对标准偏差(RSD)。结果(见表5)表明，20种农药符合残留检测规定，回收

率为70.41%～114.06%，RSD为0.76%～15.47%。标准物质、加标样品和空白样品的总离子流图见图2。

表4 20种农药的线性方程、相关系数(R2)、检出限和定量限Table 4 Linear equations，correlation coefficients(R2)，limits of detection(LODs)and limits of quantification(LOQs)of the 20 pesticides

表5 人参中20种农药的回收率和相对标准偏差(n=3)Table 5 Recoveries and RSDs of the 20 pesticides in Panax ginseng(n=3)

图2 20种农药标准溶液、人参空白和加标样品的叠加总离子流色谱图Fig．2 Superimposed total ion chromatogram of the 20 pesticides standard solution，and in blank ginseng sample and spiked ginseng sample

2．5 实际样品检测

将生长期的鲜人参样品进行烘干，粉碎成粉，采用本方法进行农药残留检测。结果表明，检测到人参样品中残效期长的有机氯类农药α-BHC、δ-BHC、六氯苯和p，p'-DDE的含量分别为0.011、0.014、0.007和0.018 mg/kg，常用杀菌剂丙环唑和乙霉威的含量分别为0.033和0.025 mg/kg。

3 结论

针对人参已登记农药及常用杀菌剂苯和有机氯类农药，采用改进的QuChERS方法对人参进行前处理，应用GC-MS检测分析，在40 min内即可完成20种农药多残留分析，整个检测只需20 mL乙腈。该方法操作简单，检出限低，符合农药残留分析的要求，具有快速、准确、环保的优点，极大地提高了检测效率，也减少了对环境的污染，保障了检验人员的健康。