陈 溪， 吴 慈， 王龙祥， 王 悦，宁兴爽， 许传鹏， 李 旺， 褚莹倩

(1．中华人民共和国大窑湾海关，辽宁大连116600;2．中华人民共和国庄河海关，辽宁庄河116400)

作为一种“新兴的环境污染物”，药品和个人护理用品(pharmaceutical and personal care products，PPCPs) 越来越引起人们的广泛关注［1］。PPCPs来源广泛，包括各种处方药、非处方药、化妆品及洗化用品等，通常被称为“伪持续性”污染物［2］。PPCPs主要通过污水处理厂排水进入环境中，进而通过饮用水进入人体，成为人体暴露于PPCPs最直接最主要的途径之一［3］，且被证明可能对生态环境和人类健康存在一定的风险［4］。

PPCPs 已经在世界范围内如美国［5，6］、意大利［7］、非洲［8］、伊朗［9］、中国［1，10－14］等的水环境中被检出，其检出水平从 ng/L至 μg/L。Monteiro等［15］分析了地表水及饮用水样品中的46个分析物，包括β-内酰胺、头孢菌素、大环内酯类和氟喹诺酮类4类抗生素;样品经过膜预处理后，酸化并经HLB柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)分析，该方法地表水的定量限为3～38 ng/L，饮用水的定量限为 0.5至 64 ng/L。Wang等［16］将样品酸化并经HLB柱净化，通过同位素稀释-二维高效液相色谱-高分辨四极杆飞行时间质谱联用技术(UHPLC-Q/TOF MS)测量了饮用水中21种常见抗生素(5种大环内酯类、2种β-内酰胺类、3种四环素类、4种氟喹诺酮类、4种磺胺类和3种苯酚类)。在自来水中检出氟苯尼考和甲砜霉素，其中值质量浓度分别为8.9 ng/L和6.4 ng/L;在个别瓶装水样品中检出氟苯尼考，质量浓度范围为1～6 ng/L。王军淋等［17］将样品酸化并经 HLB净化，采用超高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)进行分析，水源水和自来水中磺胺类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共计40种抗生素定量限范围为3～10 ng/L。Mallet等［18］则将样品经过Oasis MAX和Oasis MCX SPE的串联小柱净化，经LC-MS/MS分析，实现了水样中58种PPCPs的筛查和定量分析。综合以上研究发现，PPCPs在生活饮用水中的存在已是不争的事实，然而其种类繁杂，包括抗生素、止痛药、消炎药、降压药、避孕药、杀菌剂等，且含量很低，现有样品前处理技术针对各种PPCPs的净化能力有限，导致水样中PPCPs的筛查范围及定量准确性受到限制。本论文主要针对现有水中PPCPs类污染物检测技术和方法存在的分析通量低、方法回收率低、灵敏度低的难题，基于高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(QExactive plus)高准确度、高通量的优势，建立了水中112种PPCPs的快速筛查数据库及定量分析方法，并将其用于来自大连市7个区的水样中PPCPs的筛查及定量分析。该高通量快速筛查定量检测技术，可为水源地水质安全检测筛查提供新方法、新技术，为水质安全监测、预警和执法提供必要的技术支持。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive plus，Thermo Scientific，USA)，配可加热的电喷雾离子源(HESI);固相萃取装置(Supelco-24，USA);氮吹仪(Organomation NEVAP 112，USA)。

甲醇(HPLC级，德国 Merck公司);甲酸(HPLC级，上海安谱科学仪器有限公司);乙二胺四乙酸·二水合物(C10H14N2Na2O8·2H2O，纯度99.999%，Macklin);浓盐酸(优级纯，质量分数36%～38%，天津市化学试剂三厂);氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);过滤膜(0.45 μm，美国安捷伦公司);大体积柱管及连接转换头(25 mL，天津艾杰尔科技有限公司);Cleanert PEP-2(60 mg/3 mL，艾杰尔);高纯水经Milli-Q超纯水器纯化得到;112种PPCPs类标准品包括磺胺类抗菌药(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶等20种)，β-内酰胺类抗生素(头孢匹林、头孢他美酯、头孢噻肟等6种)，喹诺酮类抗菌药(西诺沙星、环丙沙星、达氟沙星等18种)，激素类抗炎药(甲基睾丸酮、勃地酮、睾酮等18种)，大环内酯类(克林霉素、依普菌素、林可霉素等6种)，硝基咪唑类(阿苯达唑、二甲硝咪唑、甲硝唑等6种)，氨基甲酸酯类(异丙威、抗蚜威、残杀威等7种)，四环素类(土霉素、四环素、金霉素、强力霉素4种)，β-受体阻断剂类(纳多洛尔、喷布洛儿、普萘洛尔3种)，糖尿病类(格列吡嗪、瑞格列奈、甲苯磺丁脲3种)，哮喘镇咳类(西马特罗、莱克多巴胺、克仑特罗等5种)，解热镇痛类(吲哚美辛、托麦汀、酮基布洛芬等6种)，抗炎类(茚酮苯丙酸、甲灭酸、美洛昔康等4种)，杀虫、杀螨、杀菌剂类(啶虫脒、啶酰菌胺、吡虫啉等6种)(见表1)，其纯度均大于98.3%，分别购自Sigma、Dr．Ehrenstorfer、First Standard 及 TRC 公司。

1．2 标准溶液的配制

112种PPCPs标准品用甲醇配制为质量浓度100 mg/L的储备液，再各取1 mL，用甲醇定容至100 mL，并配制混合标准工作溶液1 mg/L，放置在－18℃的冰箱中保存。取混合标准工作液0.5 mL用5%(v/v)的甲醇水溶液定容至5 mL容量瓶中，即得到100 μg/L的溶液。再根据需要用5%(v/v)的甲醇水溶液将工作液逐级稀释为100、80、50、40、25、20、10、5、2、1、0.1 μg/L，作为标准工作曲线溶液。

1．3 样品制备

酸提:向50 mL水样中加入15 μL浓盐酸，使其pH值为3，然后加入25 mg乙二胺四乙酸·二水合物，振荡溶解。

碱提:向50 mL水样中加入150 μL氨水，使其pH值为10，然后加入25 mg乙二胺四乙酸·二水合物，振荡溶解。

1．4 样品净化

采用聚乙烯二乙烯苯固相萃取(SPE)柱对所制备的样品进行净化。活化:用3 mL甲醇活化SPE柱;平衡:加入3 mL超纯水(对酸性条件下提取的样品，调超纯水pH=3;对碱性条件下提取的样品，调超纯水pH=10)，在重力作用下自然滴下，保留约1 mL的水在SPE柱中;上样:将25 mL大体积柱管用转接头连接于SPE柱上方，将制备的50 mL水样转移至管中，在真空泵的作用下，以8～10 mL/min的速度上样，上样结束后将SPE柱中的液体抽干;淋洗:在真空泵的作用下，用3 mL超纯水(pH=7)淋洗两次，然后将SPE柱中的液体抽干;洗脱:在重力作用下，用1 mL甲醇-乙腈(1∶1，v/v)洗脱3次，合并洗脱液，于40℃下氮气吹干，用1 mL 20%(v/v)的甲醇水溶液复溶，上机测定。

1．5 色谱条件

色谱柱:Accucore RP-MS(100 mm×2.1 mm，2.6 μm，Thermo Scientific);柱温:40 ℃;流动相A:0.1%(v/v)的甲酸水溶液;流动相B:0.1%(v/v)的甲酸甲醇溶液;流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL;分离梯度:5%B(0 min)－5%B(2 min)－30%B(7 min)－90%B(11 min)－90%B(13 min)－5%B(16 min)。

1．6 质谱分析条件

扫描模式:正离子模式;毛细管温度:320℃;加热温度:320℃;鞘气:N2，流速40 arb;辅助气:N2，流速10 arb;喷雾电压为(spray voltage):3 200 V;透镜电压:50 V;扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2)，一级质谱参数设置:全扫描分辨率70 000，自动增益控制目标(AGC target)1×106，最大驻留时间(maximum IT)100 ms，扫描范围m/z 100～1 000;二级质谱参数设置:分辨率17 500，AGC target 2×105，最大驻留时间 50 ms。

1．7 数据处理

若只对水样中的PPCPs进行定性筛查分析，取等体积的酸、碱提取溶液混合，进行LC-MS/MS分析。所采集的数据采用Trace Finder 3.3软件进行分析，具体筛查条件设置如下:针对一级母离子精确相对分子质量设定的参数为:(1)响应强度阈值:10 000;(2)信噪比:5.0;(3)质量允许偏差:5×10－6。针对保留时间设定的参数为:允许时间偏移为30 s。针对二级碎片离子设定的参数为:(1)最少匹配数设置为1个;(2)响应强度阈值:10 000;(3)质量允许偏差:5×10－6。

如需针对水样中的PPCPs进行定量分析，则需将酸、碱提取溶液分别进样检测，基于目标分析物的一级母离子峰面积，采用外标法进行定量，并采用Trace Finder 3.3软件进行分析。

2 结果与讨论

2．1 水质样品提取条件的选择

本实验考察了酸提取和碱提取对样品中112种PPCPs化合物的提取效果。在水样中添加112种PPCPs化合物标准品(加标水平为0.2 μg/L)，分别进行酸提取及碱提取，然后经SPE柱净化浓缩，LC-MS/MS分析，计算所得回收率。结果显示，33种PPCPs化合物适用酸提取，41种PPCPs化合物适合碱提取，其他38种化合物碱提、酸提均可，如头孢类适合于酸提取，沙星类、磺胺类、硝基咪唑类大多适合于碱性提取。因此，针对水样中不同种类PPCPs化合物的分析，应选择适当的提取方法，本试验最终确定的提取方式见表2。

2．2 LC-MS/MS 条件的优化

2．2．1 色谱柱的稳定性

本实验考察了所采用的C18色谱分离柱在使用6个月过程中目标分析物的保留时间，以分析其稳定性。以具有代表性的14种PPCPs化合物为例，其保留时间的RSD值均小于0.80%，说明此柱具有优异的稳定性，适用于筛查分析。

2．2．2 质谱条件的选择

本实验采用高分辨质谱的Full MS/dd-MS2模式，为了得到分析物的最高仪器响应值，对质谱参数进行了优化。在全扫描模式中，质谱分辨率对靶标物质的选择性和灵敏度至关重要。当分辨率增大时，质谱能够准确提取分析物的准确分子质量，使灵敏度提高;反之，当分辨率降低时，可能提取出与靶标物质具有相同碎片的干扰物，导致出现假阳性结果。但分辨率增高时，质谱扫描速率下降，导致色谱峰形变差，影响定量结果的准确性。因此需要基于所分析物质的色谱峰形，选择最佳分辨率。多次实验后，我们将一级质谱的扫描分辨率设为70 000，二级质谱分辨率设为17 500，所得112种PPCPs的提取色谱图如图1所示，可见其分辨率和分离度较好。

图1 112种PPCPs化合物的提取离子色谱图(20 μg/L)Fig．1 Extracted ion chromatograms(EIC)of 112 pharmaceutical and personal care products(PPCPs)(20 μg/L)

2．3 筛查数据库的建立及验证

本研究充分利用Q-Exactive高分辨质谱的优势，对112种PPCPs化合物采用Full MS/dd-MS2模式进行分析，获得目标物的保留时间、母离子、碎片离子精确质量数及离子化形式等信息。然后采用Xcalibur软件对112种化合物进行模拟碎裂，以各化合物二级质谱图中实际碎片离子质量数与理论精确质量数偏差小于5×10－6，且丰度在前五强的离子作为特征碎片离子。最后以112种PPCPs化合物的保留时间、母离子理论精确质量数和特征二级碎片离子的理论精确质量数，建立筛查数据库(见表1)，用于水中PPCPs的筛查。

表1 112种PPCPs的筛查数据库Table 1 Screening database for the 112 PPCPs

表1 (续)Table 1 (Continued)

表1 (续)Table 1 (Continued)

为了验证此筛查方法的可靠性，在添加水平为0.2 μg/L时，107种 PPCPs化合物均被“Confirmed”(确证出)，1种 PPCPs化合物显示“Not Found”(未检出)，4种PPCPs化合物显示“Identified”(识别出，但存疑)，其确证率达到95.5%;样品添加水平为0.4 μg/L时，109种PPCPs化合物均被“Confirmed”，3种 PPCPs化合物显示“Identified”可疑，其确证率达到97.3%;样品添加水平为0.8 μg/L时，111种 PPCPs化合物均被“Confirmed”，1种PPCPs化合物显示“Identified”可疑，其确证率达到99.1%。

2．4 方法的线性关系、定量限和回收率

以目标物母离子的提取色谱峰面积为纵坐标y，以目标物的质量浓度为横坐标x，绘制标准曲线。所有PPCPs化合物在一定的浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99(见表2)。在空白蒸馏水中添加低浓度的目标化合物，经过样品提取及净化，进样分析，测得各种PPCPs的定量限如表2所示，定量限在0.002～0.8 μg/L之间。

向空白水样中添加112种PPCPs标准溶液在3个水平下进行添加回收试验(0.2、0.4、0.8 μg/L)，每个水平重复6次。在添加水平为0.2 μg/L时，平均回收率范围为60.7%～129.5%，相对标准偏差范围(RSD)为1.4%～17.8%;在添加水平为0.4 μg/L时，平均回收率范围为60.1%～122.6%，RSD为1.3%～15.8%;在添加水平为0.8 μg/L时的平均回收率范围为 63.1%～120.1%，RSD为 1.1%～10.7%。

表2 112种PPCPs的线性关系、定量限及提取方法Table 2 Linear relationships，limits of quantification(LOQs)and extraction methods for the 112 PPCPs

表2 (续)Table 2 (Continued)

表2 (续)Table 2 (Continued)

2．5 实际水样中PPCPs的分析

将所建立的方法用于来自大连市高新园区、中山区、西岗区、甘井子区、旅顺区、庄河、普兰店7个地区的水样中PPCPs的分析，每个区域随机选择了1个地点取自来水样。首先对每个水样中的PPCPs进行筛查分析，然后分别对样品中筛查为阳性的化合物进行定量分析。根据筛查结果可知，共有16种PPCPs化合物分别在7个水样中被筛查为阳性。具体确证原理以甘井子区水样中检出为阳性的甲氧苄啶为例来说明。如图2所示，样品中甲氧苄啶的保留时间(6.00 min)与数据库中标准品一致，一级母离子精确质量数(291.144 87)与理论值(291.145 17)相差小于 5×10－6，且二级质谱图中的4个碎片离子(m/z275.112 92，261.097 93，245.102 63，123.066 56)与筛查数据库中标准品的碎片离子也一致，因此可以判断此样品中甲氧苄啶为阳性。进一步对这16种PPCPs进行定量分析，结果见表3。

表3 大连市7个区随机水样中筛查为阳性的16种PPCPs的含量Table 3 Mass concentrations of 16 PPCPs in random positive water samples from seven regions in Dalian city ng/L

图2 某阳性水样中甲氧苄啶的(a)一级提取离子流图、(b)二级总离子流图和(c)二级质谱图Fig．2 (a)EIC of MS，(b)total ion chromatogram(TIC)of MS/MS and(c)MS/MS profile of trimethoprim detected in a positive water sample

3 结论

本研究发展了一种快速、简单的样品前处理方法，基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱实现了水质中112种PPCPs的快速筛查和定量分析。本方法中我们基于保留时间、母离子及子离子精确相对分子质量建立了112种PPCPs的数据库，用于目标分析物的筛查，并可基于一级母离子提取峰面积实现准确定量。该方法快速、准确，灵敏度高，筛查范围广，为水质的风险监测提供了一种有力的技术手段，可为食品安全监管提供有效的技术保障。