超高效液相色谱-串联质谱同时测定植物油中14种营养成分

2018-11-06彭祖茂邓梦雅张协光郑裕辉

色谱 2018年11期

彭祖茂，朱丽，邓梦雅，张协光，郑裕辉

(深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量监督检验中心(广东)，广东深圳518109)

食用植物油是人们日常生活的必需品之一。在我国主要食用植物油有大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、芝麻油、橄榄油、山茶油和亚麻籽油等。随着人们对营养膳食需求的提高，食用植物油的营养功能也备受关注［1－3］。但是，人们对植物油中营养成分的了解更多停留在脂肪酸的组成上，对植物油中其他微量的营养成分知之甚少。市面上不同植物油的辨别也主要根据脂肪酸组成来区分［4］。除脂肪酸外，植物油中还存在维生素E、植物甾醇、角鲨烯、类胡萝卜素等营养成分［5－7］。然而，向植物油中掺入其他少量廉价植物油也会存在脂肪酸组成合格的情况。因此，仅仅依靠脂肪酸组成来判断植物油是否为纯正植物油存在一定漏洞，给不法商家提供了掺假、掺伪的可乘之机。

维生素 E 包括生育酚(α-生育酚(α-T)、β-生育酚(β-T)、γ-生育酚(γ-T)、δ-生育酚(δ-T))和生育三烯酚(α-生育三烯酚(α-T3)、β-生育三烯酚(β-T3)、γ-生育三烯酚 (γ-T3) 和 δ-生育三烯酚(δ-T3))。维生素E的主要检测方法有反相液相色谱法和正相液相色谱法［8，9］。反相液相色谱法主要采用C30色谱柱或五氟苯基(PFP)色谱柱，以甲醇-水为流动相;而正相色谱法则采用硅胶柱，以正己烷等为流动相，但是稳定性较反相色谱法差，色谱柱使用寿命短。此外，气相色谱法［10－12］也被用于食品中维生素E的检测。

植物甾醇是一类以环戊烷多氢菲为骨架的物质［13］，植物油中主要含有菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇，主要分离手段有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法和高速逆流色谱法，同时结合紫外检测器和质谱检测手段，以实现不同甾醇的定性和定量分析［14－16］。

β-胡萝卜素是一种类胡萝卜素，在450 nm处有较强吸收，高效液相色谱-紫外检测法和超高效液相色谱-质谱法是 β-胡萝卜素的主要检测方法［17，18］。高效液相色谱法分析时间长，有机溶剂消耗大;超高效液相色谱-质谱法分析时间快，溶剂消耗少。

角鲨烯是一种全反式三萜烯化合物［19］，主要采用气相色谱法-氢火焰检测器法、气相色谱法-质谱法或高效液相色谱法检测，其中以气相色谱法分析最为普遍［20－22］。

维生素E、β-胡萝卜素、植物甾醇和角鲨烯均属于不皂化物，可以建立一种快速、同步分析植物油中不同营养成分的高通量检测方法［23－26］。但受色谱柱或检测器的限制，已有分析的方法主要集中分析维生素E中的α-T，植物甾醇中的谷甾醇和豆甾醇。目前尚未有同时分析8种维生素E、4种植物甾醇、β-胡萝卜素和角鲨烯的报道。本课题拟采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术，建立同步检测植物油中8种维生素E、4种植物甾醇、β-胡萝卜素和角鲨烯共14营养成分含量的方法，旨在为食用植物油的溯源技术研究奠定基础，为相关企业，监督机构以及消费者提供技术依据。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

Ultimate 3000超高效液相色谱仪、TSQ Quautis三重四极杆质谱仪(美国Thermo Fisher公司);Hei-VAP旋转蒸发仪(德国Heido1ph公司);Sartorius万分之一电子天平(北京赛多利斯公司)。

标准品:α-T、β-T、γ-T、δ-T(纯度≥98%，美国Supelco 公司); α-T3、β-T3、γ-T3和 δ-T3(纯度≥98%)、β-胡萝卜素(纯度≥97%)、角鲨烯(纯度≥99.0%)(美国Sigma-Aldrich公司);菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇(纯度≥98%，上海Anpel公司)。14种标准品的结构式见图1，用甲醇配制14种标准品的标准储备液，于－18℃下保存。

甲醇、甲酸(色谱纯，德国Merck公司);无水乙醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司);氢氧化钾、无水硫酸钠、抗坏血酸和石油醚(分析纯，广州化学试剂厂)。

1．2 样品前处理

称取植物油样品0.1 g(精确至0.000 1 g)，置于锥形瓶中，加入2 g抗坏血酸、10 mL水，涡旋振荡摇匀，然后加入30 mL无水乙醇和15 mL 50%(v/v)氢氧化钾水溶液，摇匀，于70℃皂化1 h;冷却后，用40 mL石油醚萃取3次，合并提取液，用水洗涤至中性，将石油醚层转移至鸡心瓶中，旋至近干，氮气吹干后，用甲醇定容，过0.22 μm 有机滤膜，待分析。

1．3 色谱条件

色谱柱:Poroshell 120 PFP柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm);柱温:30℃;流动相:A 为 0.1%(v/v)甲酸水溶液，B为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0～1.0 min，85%B～95%B;1.0～7.0 min，95%B;7.0～12.5 min，95%B～100%B;12.5～ 13.0 min，100%B～85%B。进样量:5 μL。

图1 14种营养成分的化学结构式Fig．1 Chemical structures of the 14 nutrients

1．4 质谱条件

离子源:大气压化学电离(APCI)源;离子模式:正离子模式;扫描方式:多反应监测(SRM)模式;离子源温度:300℃;离子传输管温度:300℃;充电电流:6 μA;鞘气(N2)流速:9 L/min;辅助气(N2)流速:1.5 L/min;吹扫气流速:0.6 L/min。14种营养成分的质谱参数见表1。

表1 14种营养成分的质谱参数Table 1 MS parameters of the 14 nutrients

2 结果与讨论

2．1 离子源的选择

实验考察了电喷雾电离(ESI)源和APCI源对14种营养成分的离子化效果。结果发现，采用ESI源时，部分维生素E和β-胡萝卜素的离子化效率较低。采用APCI源时，维生素E和β-胡萝卜素、植物甾醇以及角鲨烯均能达到较高的离子化程度，其中植物甾醇中［M+H－H2O］+碎片离子的响应最高;角鲨烯的子离子中m/z为149的碎片离子响应强度高于m/z为231的碎片离子。但是，以m/z 149为定量离子时，β-T3、γ-T3也会有响应，为减少干扰，选择m/z 231为定量离子。

2．2 色谱柱的选择

前期研究［27］发现，Poroshell 120 PFP 色谱柱在反相液相色谱系统下，不仅能实现β-T、γ-T和β-T3、γ-T3的分离，还能同时完成 β-胡萝卜素和磷酯类物质的基线分离。同时发现菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和 β-谷甾醇以及角鲨烯在 Poroshell 120 PFP色谱柱上也有很好的分离效果，且峰形尖锐，分析时间快，在12 min内便可完成所有物质的检测(见图2)。因此实验选择Poroshell 120 PFP为分析色谱柱。

图2 14种营养成分的提取离子色谱图Fig．2 Extracted ion chromatograms of the 14 nutrients

2．3 基质效应(ME)

基质效应是指目标物以外的其他组分对目标物测定值的影响，包括基质抑制效应和基质增强效应，用离子基质抑制率或增强率(L)表示。L=(基质匹配标准曲线的斜率－溶剂标准曲线的斜率)/溶剂标准曲线的斜率×100%，当L＞0，表示基质增强效应;当L＜0，表示基质抑制效应。实验考察了14种营养成分在实际样品中的基质效应，得到基质效应分布结果(见图3)。结果发现，实际样品中基质对5种营养成分(β-胡萝卜素、α-T3、α-T、菜油甾醇和豆甾醇)有抑制效应，可能是内源性物质对APCI源离子化过程中的电离抑制效果导致;其余9种营养成分均有基质增强效应。

图3 14种营养成分的离子抑制或增强率Fig．3 Ion suppression or enhancement percentages of the 14 nutrients

2．4 线性范围、检出限和定量限

分别取14种营养成分的标准储备液，配制质量浓度为0.05～10.0 mg/L的标准工作液，以营养成分的质量浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线(见表2)。结果表明，14种营养成分在0.05～10.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.997 1。检出限和定量限分别以3倍信噪比(S/N)和10倍S/N计，结果表明，检出限为0.01～0.30 μg/g，定量限为0.04～1.00 μg/g。

2．5 回收率与精密度

选取混合植物油为样品，分别加入0.05、1.00和5.00 mg/L的混合标准溶液，考察低、中、高不同添加水平下14种营养成分的回收率(见表3)。结果表明，14种营养成分的加标回收率为80.7%～100.5%，相对标准偏差(RSD)均＜6.0%。

表2 14种营养成分的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of the 14 nutrients

表3 14种营养成分的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 14 nutrients(n=6)

2．6 稳定性

选取混合植物油为样品，按1.2节描述处理，然后将混合植物油提取液分别保存 0、4、8、12、24、48和72 h，然后检测14种营养物质的峰面积(见图4)。结果发现，在72 h内，14种营养成分的稳定性好，其峰面积的相对标准偏差均小于9.7%。

图4 提取液存放时间对14种营养成分峰面积的影响(n=6)Fig．4 Effect of different storage time on the peak areas of the 14 nutrients(n=6)

2．7 实际样品测定

本方法选取常见的11种植物油进行分析(见表4)。结果表明，11种植物油中除活性最高的α-T外，还存在其他形式的生育酚和生育三烯酚。在菜籽油和橄榄油中检出β-胡萝卜素，含量分别为(4.7±0.6)mg/kg 和(4.4±0.2)mg/kg。植物油中还含有大量的植物甾醇，在菜籽油、玉米油中含量最高，在山茶油中含量最低;其中，大豆油中豆甾醇含量是所有植物油中含量最高的，而在菜籽油、橄榄油和核桃油中均未检出豆甾醇，因此，豆甾醇可以作为大豆油的特征营养指标。角鲨烯在橄榄油中的含量最高，芝麻油中最低。因此，角鲨烯可以作为橄榄油的特征营养指标。

表4 实际植物油样品中14种营养成分的含量(，n=3)Table 4 Contents of the 14 nutrients in real plant oil samples(，n=3)mg/kg

ND:not detected．

Compound Rapeseed oil oil peanut oil oil oil oil oil oil oil esame oil Walnut oil Peanut Black Corn Soybean Olive Camellia Linseed Cannabis S α-T 124．0±6．2 159．7±4．8 146．3±5．5 157．5±8．2 103．7±2．3 149．6±6．7 94．6±4．5 16．1±0．5 49．8±1．7 22．0±0．2 12．9±0．59 γ-T 376．8±17．9 145．7±3．8 123．1±1．1 442．4±15．5 504．8±21．0 17．8±0．4 14．5±0．2 153．4±1．6 385．4±4．8 313．4±13．4 81．4±3．9 β-T ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND δ-T 26．4±0．7 27．3±0．5 22．7±0．7 33．1±1．5 118．0±4．0 13．2±0．6 15．6±0．3 14．0±0．6 26．7±0．9 25．5±0．4 25．9±1．1 α-T3 2．3±0．04 2．7±0．05 3．1±0．2 12．5±0．3 2．9±0．05 3．3±0．1 2．9±0．04 3．0±0．1 3．0±0．1 2．8±0．05 3．1±0．05 γ-T3 7．4±0．04 8．2±0．04 8．4±0．6 11．9±0．4 8．8±0．1 2．8±0．04 2．6±0．05 2．7±0．1 3．2±0．2 9．2±0．2 3．0±0．06 β-T3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND δ-T3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND β-Carotene 4．7±0．6 ND ND ND ND 4．4±0．2 ND ND ND ND ND Brassicasterol 1138±36．6 11．1±1．1 17．6±2．2 71．8±4．4 24．6±0．2 1．2±0．07 4．5±0．4 65．3±1．7 20．9±1．9 45．0±2．1 18．9±0．9 Campesterol 2158±94．3 301．9±13．4 379．5±8．8 1421±87．5 535．2±28．8 48．8±2．2 30．8±1．5 619．8±17．0 565．7±20．0 770．3±23．8 77．2±0．6 Stigmasterol ND 233．4±17．4 250．3±14．5 473．4±19．0 511．8±9．0 ND 31．6±2．0 210．2±9．4 79．4±3．4 375．4±13．7 ND β-Sitosterol 3226±80．6 1369±64．7 1573±34．9 4288±74．6 1339±33．8 1014±23．0 55．2±1．5 1173±10．2 2450±38．4 2648±79．0 1059±34．3 Squalene 42．2±1．7 147．4±4．3 140．8±4．3 111．7±4．0 46．0±1．2 4310±11．9 87．7±3．1 24．6±0．9 86．7±1．6 20．1±0．9 28．2±0．8