方从容， 高 洁， 王雨昕， 周 爽， 赵云峰， 陈达炜*， 郭启雷

(1．国家食品安全风险评估中心，卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京100021;2．安捷伦科技有限公司，北京100102)

我国是鲜蛋生产和消费大国，为防止禽类疫病发生，兽药被广泛应用于对禽类的治疗，但由于经济利益驱使，养殖户往往滥用各种抗生素，造成禽蛋中兽药残留超标的现象时有发生［1，2］。中华人民共和国农业部公告第193号和278号明确规定了食品动物禁用的一系列药物清单，其中包括性激素类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、硝基咪唑类等兽药。现在迫切需要建立鸡蛋中兽药多残留的高通量快速检测方法。

国标方法［3－7］采用的是分类检测各类兽药，优点是样品前处理适用范围广，缺点是样品前处理复杂，完成不同种类的兽药检测耗时较长。超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)因具有高灵敏度、高选择性的优势已被广泛用于兽药多残留分析，但在蛋类样品中同时检测硝基咪唑类、苯并咪唑类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、激素类(雄激素、孕激素、糖皮质类激素、雌激素类)兽药还鲜有报道。冷冻脂质过滤净化在低温(≤－20℃)条件下将提取液中的脂质析出，适用于富含脂类的动物性食品;而基于分散固相萃取(dispersive solid-phase extraction，DSPE)的 QuECh-ERS方法因其样品用量少、试剂消耗少、操作简单、有效等特点，已成为快速分析兽药残留检测技术的发展趋势［8－19］。本研究采用DSPE法结合冷冻脂质过滤法处理样品，同时测定蛋类样品中11类共125种禁限用兽药，与国标方法相比，本研究所建方法操作更为简单、快速，适用于蛋类样品中兽药残留的高通量快速分析。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

6495型超高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子(ESI)源，美国安捷伦公司;3K15型冷冻离心机(最大转速10 000 r/min)，购自Sigma公司。

乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，购自Fisher公司;125种兽药标准品均购自德国Dr．Ehrenstorfer公司(见表1);氟化铵(NH4F)纯度大于99.99%，购自上海阿拉丁试剂有限公司;C18粉(50 μm，6 nm)以及 DSPE混合净化剂(50 mg N-丙基乙二胺(PSA)+50 mg C18+250 mg Na2SO4)购自天津博纳艾杰尔公司;乙二胺四乙酸二钠(EDTA)购自广东汕头市西陇化工厂。

表1 125种兽药的质谱采集参数、保留时间(tR)、线性范围、相关系数Table 1 MS parameters，retention times(tR)，linear ranges，correlation coefficients(R2)of the 125 veterinary drugs

表1 (续)Table 1 (Continued)

表1 (续)Table 1 (Continued)

表1 (续)Table 1 (Continued)

1．2 标准溶液的配制

1．2．1 兽药标准储备液

分别称取各兽药标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度均为1 g/L的标准储备液，于－20℃条件下保存。

1．2．2 兽药混合标准使用液

分别吸取适量兽药标准储备液(1 g/L)，用甲醇配制成中间液;再分别吸取0.5 mL磺胺类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL喹诺酮标准中间液(10 mg/L)、0.5 mL大环内酯类标准中间液(100 mg/L)、0.5 mL四环素类标准中间液(100 mg/L)、1.0 mL硝基咪唑类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL苯基咪唑类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL雄激素类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL孕激素类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL雌激素类标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL糖皮质醇类激素标准中间液(10 mg/L)、1.0 mL氯霉素类标准中间液(10 mg/L)置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，置于－20℃冰箱中保存。磺胺类兽药的质量浓度为0.5 mg/L，四环素类和大环内酯类兽药的质量浓度为5.0 mg/L，其他8类兽药的质量浓度为1.0 mg/L。

1．2．3 兽药混合标准工作曲线

吸取适量125种兽药标准使用液，用初始流动相稀释成质量浓度为0.025～500.0 μg/L标准工作曲线，于4℃条件下保存。

1．3 样品处理

取10枚鸡蛋混合均匀，称取2.0 g(精确到0.01 g)混匀的蛋液于50 mL离心管中，加入1.0 mL水和0.4 mL的0.1 mol/L EDTA溶液，混匀后再加入7 mL乙腈涡旋(1 600 r/min)混匀5 min，在4℃条件下离心(10 000 r/min)5 min，上清液转移至10 mL离心管中，加水定容至10 mL，于－20℃冷冻2 h后，在4℃条件下离心(10 000 r/min)5 min，取1.0 mL上清液，加入DSPE混合净化剂(50 mg PSA+50 mg C18+250 mg Na2SO4)，涡旋 30 s后，取上清液0.3 mL加入0.6 mL水稀释，混匀后过0.2 μm有机微孔滤膜，滤液注入UHPLC-MS/MS分析。

1．4 仪器分析条件

UHPLC在正离子模式下的条件:ZORBHX C18色谱柱(3.0 mm ×100 mm，1.8 μm);流速 0.4 mL/min;流动相 A:0.5 mmol/L NH4F-0.1%(v/v)甲酸溶液，流动相B:0.1%(v/v)甲酸甲醇;梯度洗脱:2%B保持1 min，在1 min内增至20%B，在6 min内增至28%B，在0.5 min内增至60%B，在7 min内增至98%B(保持3 min);柱温40℃;进样量1 μL。

UHPLC在负离子模式下的条件:ZORBHX C18色谱柱(100 mm ×3.0 mm，1.8 μm);流速 0.4 mL/min;流动相A:1 mmol/L NH4F溶液，流动相B:甲醇;梯度洗脱:20%B保持0.5 min，在1 min内增至50%B，在4 min内增至70%B(保持3 min)，在0.1 min内增至100%B(保持2 min);柱温40℃;进样量 5 μL。

质谱条件:ESI源;正负离子模式;干燥气温度210℃;干燥气流速13 L/min;雾化器温度压力245 kPa;鞘气温度400℃;鞘气流速12 L/min;毛细管电压(正离子)3 500 V，毛细管电压(负离子)3 000 V;多反应监测(MRM)离子对、质谱采集参数、保留时间、线性范围、相关系数(R2)见表1，其中以化合物的色谱保留时间和两对MRM离子对进行定性，定量MRM离子对的峰面积进行定量。

采用正离子模式分析的114种兽药总离子流图见图1a，采用负离子模式分析的11种兽药总离子流图见图1b。

图1 (a)正离子模式分析114种兽药和(b)负离子模式分析11种兽药的总离子流图Fig．1 Total ion chromatograms of(a)the 114 veterinary drugs in positive ion mode and(b)the 11 veterinary drugs in negative ion mode

2 结果与讨论

2．1 流动相的选择

选择ZORBHX C18为分析柱，选取0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸甲醇、0.2%(v/v)甲酸水溶液-0.2%(v/v)甲酸甲醇、1 mmol/L NH4F水溶液-甲醇、1 mmol/L NH4F水溶液-甲酸-甲醇为流动相，考察4种流动相对125种化合物色谱行为、灵敏度的影响。结果表明，以正离子模式分析兽药化合物时，在甲酸水溶液-甲酸甲醇体系中，随着酸度的增加，四环素类、喹诺酮类化合物色谱峰峰形得到改善;但大多数的雄激素、孕激素和糖皮质醇激素类化合物的灵敏度降低了5%～50%。1 mmol/L NH4F水溶液-甲醇体系会使绝大多数化合物的灵敏度提高0.5～2倍，但四环素类、喹诺酮类化合物的色谱峰峰型较宽，且明显前伸;在1 mmol/L NH4F水溶液-甲醇中加入甲酸，四环素类、喹诺酮类化合物峰形比溶液-甲醇体系明显改善，峰宽变窄，峰形对称，所有化合物的灵敏度都满足本方法分析的要求。因此，选择NH4F水溶液-甲酸-甲醇体系作为正离子模式分析兽药化合物的流动相体系，再对此流动相进行优化，最终选定0.5 mmol/L NH4F+0.1%(v/v)甲酸水和0.1%(v/v)甲酸甲醇为流动相。对负离子模式下分析的雌激素、氯霉素类等化合物，经比较，NH4F水溶液-甲醇体系的灵敏度最高，因此选择1 mmol/L NH4F水和甲醇为流动相。其中，四环素和萘啶酸在4种流动相中的色谱图见图2。

2．2 样品前处理方法的选择与优化

所分析的11类兽药化合物由于极性不同，在蛋黄和蛋清中分布不同，因此必须将两者混合均匀。从提取溶剂的优化、EDTA缓冲溶液对四环素类和喹诺酮类兽药萃取率的影响、QuEChERS结合冷冻脂质过滤净化法对降低基质效应的作用等方面进行了研究。考察的方式是:对空白鸡蛋进行兽药加标回收试验，磺胺类加标量为25 μg/kg，四环素类和大环内酯类加标量为250 μg/kg，其余喹诺酮类、激素类(雄激素、孕激素、糖皮质醇激素、雌激素)、氯霉素类、硝基咪唑类和苯并咪唑类兽药加标量为50 μg/kg，外标法计算加标回收率，相对标准偏差(RSD)和基质效应(ME)。

图2 四环素和萘啶酸在4种流动相体系中的色谱图Fig．2 Chromatograms of tetracycline and nalidic acid in four mobile phase systems

2．2．1 提取溶剂的选择

2．2．1．1 提取溶剂的初步优化

鸡蛋中兽药多残留分析所选用的溶剂包括乙腈-水-缓冲液、乙腈-水-酸、甲醇-水-酸等溶剂，根据文献［16－19］选取了乙腈-水(70 ∶30，v/v)、乙腈-水-甲酸(70 ∶30∶1，v/v/v)、甲醇-水(70 ∶30，v/v)、甲醇-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)4种溶剂作为提取溶剂。实验过程中发现，采用甲醇-水(70∶30，v/v)和甲醇-水-甲酸(70 ∶30 ∶1，v/v/v)为提取溶剂时，鸡蛋中的蛋白质沉淀物松散，离心后倾出上清液时，沉淀物极易带出，且－20℃低温下冷冻提取液2 h后，脂类物质难被析出。因此选择乙腈-水(70∶30，v/v)和乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)作为提取溶剂，计算空白鸡蛋加标回收率、RSD和ME。

结果显示，对多数磺胺类兽药来说，以乙腈-水(70∶30，v/v)为提取溶剂时的加标回收率比乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)时高 10%～20%;6 种苯基咪唑类兽药中，阿苯达唑亚砜在乙腈-水(70∶30，v/v)和乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)为提取溶剂时的加标回收率分别为98%和80%，其余5种苯基咪唑类兽药在两种提取溶剂中的回收率相当;9种孕激素兽药中，孕酮在乙腈-水(70∶30，v/v)和乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)中的加标回收率分别为90.4%和62%，其余8种兽药在两种提取溶剂中的回收率差异不大;14种皮质醇激素中，除曲安西龙在乙腈-水(70∶30，v/v)和乙腈-水-甲酸(70 ∶30 ∶1，v/v/v)中的加标回收率分别为73%和51%外，其余13种兽药的回收率相当;7种雌激素以乙腈-水(70∶30，v/v)为提取溶剂时，双烯雌酚、己烯雌酚和己烷雌酚的加标回收率在61%～69%之间，乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)的加标回收率在14.7%～44.7%之间，其他4种雌激素在两种提取溶剂中的回收率在66.4%～104.0%之间;喹诺酮类兽药以乙腈-水(70∶30，v/v)为提取溶剂时，6种喹诺酮的加标回收率在41%～58%之间，7种喹诺酮的加标回收率在66%～83%之间，6种喹诺酮的加标回收率在107%～122%之间，而以乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)为提取溶剂时，19种喹诺酮的加标回收率在60%～89%之间。采用乙腈:水(70∶30，v/v)为喹诺酮类提取溶剂的最大问题是基质效应明显增强，有10种喹诺酮类兽药(洛美沙星、吡哌酸、二氟沙星、培氟沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星、沙拉沙星)的基质效应在24.9%～99.7%之间。四环素类兽药在两种提取溶剂中的回收率均较低(＜25%)，且基质效应较高;其他16种硝基咪唑类、4种氯霉素类、14种雄激素类、8种大环内酯类兽药在两种提取溶剂中的加标回收率基本相当;但以乙腈-水(70∶30，v/v)为提取溶剂时，红霉素的基质效应为112%，是乙腈-水-甲酸(70∶30∶1，v/v/v)中基质效应的3倍。11类兽药在两种提取溶剂下的加标回收率范围、RSD和ME范围见表2。

表2 两种提取溶剂下11类兽药的加标回收率、RSD(n=3)和基质效应Table 2 Recoveries，RSDs(n=3)and the matrix effects(MEs)of the 11 veterinary drugs with two extraction solvents

2．2．1．2 EDTA 溶液对四环素类、喹诺酮类、红霉素、雌激素类兽药提取率的影响

乙腈-水(70 ∶30，v/v)和乙腈-水-甲酸(70 ∶30 ∶1，v/v/v)两种提取溶剂对四环素类兽药的提取率极低，是由于四环素类兽药与鸡蛋样品中含有的金属离子和蛋白质相结合而造成的。因此，根据文献报道［16－17］，在两种提取液中分别加入 0.1 mL 0.1 mol/L EDTA溶液和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，使金属离子与EDTA溶液结合，从而使四环素类兽药解离，同时也考察加入0.1 mol/L EDTA溶液对喹诺酮类、雌激素类兽药和红霉素提取率以及基质效应的影响。

结果表明，对于乙腈-水(70∶30，v/v)提取液，随着EDTA的增加，四环素类和喹诺酮类兽药回收率明显提高，四环素类兽药的回收率＞60%，RSD＜10%，但基质效应仍很高，在284%～723%之间;喹诺酮类兽药的回收率＞70%，RSD＜10%，基质效应有不同程度的下降，如氟罗沙星从添加EDTA溶液前的99.7%降至58.9%;双烯雌酚、己烯雌酚和己烷雌酚加入EDTA溶液后，加标回收率无明显变化;红霉素的基质效应在加入EDTA溶液后没有任何改善。

对于乙腈-水-甲酸(70 ∶30 ∶1，v/v/v)提取液，加入0.1 mL和0.4 mL的0.1 mol/L EDTA溶液后，四环素类兽药的回收率与乙腈-水(70∶30，v/v)时相当，且随着0.1 mol/L EDTA溶液量的增加，基质增强效应明显提高到＞200%;喹诺酮类兽药随着EDTA溶液量的增加，回收率无明显变化;双烯雌酚在加入EDTA溶液后的回收率由17%提升到44%;己烯雌酚的回收率由15%提升到30%，但己烷雌酚的加标回收率没有改善，仍为44%左右。

综合比较两种提取溶剂及加入EDTA溶液后11类125种兽药的加标回收率、RSD和ME，选定乙腈-水(70∶30，v/v)加入 0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液为最优的提取溶剂。喹诺酮类兽药、四环素类兽药、红霉素的基质增强效应较高，说明提取液中仍含有脂肪酸、磷脂等干扰物质，需进一步净化。加入EDTA溶液后四环素类(250 μg/kg)的加标回收率、RSD(n=3)、ME 见表3。在乙腈-水(70 ∶30，v/v)提取液中，喹诺酮类兽药在加入EDTA溶液后加标回收率的变化情况见图3。

表3 两种提取溶剂中加入EDTA溶液(0.1 mol/L)后四环素类兽药(250 μg/kg)的加标回收率、RSD(n=3)和基质效应Table 3 Recoveries，RSDs(n=3)and MEs of tetracycline(250 μg/kg)after EDTA solution(0.1 mol/L)added in two extraction solvents

图3 提取液中加入不同体积0.1 mol/L EDTA溶液对喹诺酮类兽药(50 μg/kg)回收率的影响Fig．3 Effect of added volume of 0.1 mol/L EDTA solution on the recoveries of quinolones(50 μg/kg)

2．2．2 QuEChERS 方法的优化

乙腈-水(70∶30，v/v)提取液经 QuEChERS 净化之前，在－20℃下冷冻2 h，可明显观察到底层溶液有沉淀析出(冷冻脂质过滤净化)，离心后将上层溶液再经DSPE方法净化，能显著降低基质效应的影响。本研究比较了C18粉和DSPE混合净化剂(50 mg PSA+50 mg C18+250 mg NA2SO4)对降低四环素类、喹诺酮类、红霉素等兽药基质增强效应的影响。结果显示，采用混合净化剂净化后，喹诺酮类兽药的基质效应＜15%，红霉素基质效应由112%降至38%，四环素类兽药基质效应＜20%。11类125种兽药中，吡哌酸的回收率为65%，17b-羟基雄烷-3-酮回收率为61%，美雄诺龙回收率为65%，四环素类兽药回收率在60%～76%之间，其他类兽药回收率在86%～119%之间，基质效应在－14.1%～20%之间，RSD在0.3%～14%之间。

因此，本方法最终选择乙腈-水(70∶30，v/v)为提取溶剂，加入0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，涡旋提取5 min，离心后上清液在－20℃下冷冻2 h，上清液再用DSPE混合净化剂(50 mg PSA+50 mg C18+250 mg Na2SO4)净化，将净化液稀释3倍后用UHPLC-MS/MS分析，125种兽药的回收率、RSD、基质效应均获得满意的结果。

2．3 方法的线性关系、定量限、准确度和精密度

125种兽药在各自的线性范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.993～0.999。以信噪比≥10确定方法的定量限(LOQ)，硝基咪唑类和苯基咪唑类的LOQ在2～5 μg/kg之间;除磺胺氯哒嗪的LOQ为5 μg/kg外，其余磺胺类的LOQ均为2 μg/kg;喹诺酮类的LOQ在5～25 μg/kg之间;大环内酯类除水合白霉素的LOQ为60 μg/kg、红霉素的 LOQ 为 20 μg/kg，其他大环内酯类兽药的LOQ均为10 μg/kg;四环素类的LOQ在10～20 μg/kg之间;氯霉素类除氟苯尼考的LOQ为10 μg/kg，其他3种兽药的 LOQ 均为5 μg/kg;雄激素类和糖皮质醇激素类的LOQ在5～20 μg/kg之间;孕激素类和雌激素类的LOQ在5～10 μg/kg之间。

按兽药在LOQ、2倍LOQ、5倍LOQ 3个水平做加标回收率试验，每个水平做5个平行样品，125种兽药在鸡蛋中的平均回收率和RSD见表4。由表4可以看出，125种兽药在鸡蛋中的平均回收率在60.4%～119.3%之间，RSD在0.3%～16.1%之间，符合多残留分析的要求。

表4 (续)Table 4 (Continued)

表4 (续)Table 4 (Continued)

2．4 实际样品的测定

于天津和北京的超市和农贸市场采集83份鸡蛋、9份鸭蛋、6份鹅蛋，用构建的方法测定98份蛋类样品中的125种兽药。检测结果显示，3份样品中检出氟苯尼考和氟苯尼考胺，残留量分别在34.4～112.4 μg/kg和 6.5～30.9 μg/kg 之间;4 份样品中检出甲硝唑(6.5～60.5 μg/kg);9份样品中检出甲硝唑代谢产物(10.3～368.3 μg/kg);4份样品中检出甲氧苄啶(5.0～33.4 μg/kg);3份样品中检出磺胺氯吡嗪(3.8～91.0 μg/kg);1份样品中检出林可霉素(16.5 μg/kg);1份样品中检出氧氟沙星(76.9 μg/kg)。

3 结论

本研究建立了11类共125种兽药的冷冻脂质过滤结合QuEChERS净化的样品前处理和UHPLCMS/MS高通量检测方法，与国标方法相比，缩短了检测周期，节约了检测成本。该方法操作简便、快速，净化效果好，灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求，为各食品检测机构提供了鸡蛋样品中禁限用兽药日常监控的筛选方法。