首都医科大学附属北京世纪坛医院（100038）李素云 吉琳琳

军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所（300050）李素云 高蔚娜 郭长江

军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所（100850）李峥 张振清

槲皮素及其糖苷衍生物是一类广泛存在于植物性药物和食物中的黄酮化合物之一[1]，普遍存在于水果、蔬菜、茶叶及中草药中，是黄酮家族中重要的成员，具有多样的生物学效应，如抗氧化、抗炎症反应、抗肥胖、抗生物膜及抗肿瘤等活性[2]。槲皮素及其糖苷衍生物在肠道吸收过程中即发生广泛的代谢，门静脉中几乎检测不到原形的存在，其中甲基化反应是其最基本的代谢形式，进一步的葡糖糖醛酸化和/或硫酸化使其代谢产物众多、数量极少、难于定性和定量[3]，且由于槲皮素在自然环境下极不稳定，易被氧化，因此，槲皮素及其代谢产物的分析成为槲皮素及其糖苷衍生物研究中的难点之一。目前，槲皮素及其糖苷衍生物和相关代谢产物主要采用HPLC、HPLC-MS/MS等分析方法，但样品处理方法复杂，对槲皮素及其代谢产物的影响不易评估。笔者参考国内外有关文献，建立了HPLC-MS检测法，可同时测定槲皮素及其甲基化代谢产物异鼠李亭和柽柳黄素，并初步应用于细胞培养条件下的样品测定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 二氧化碳细胞培养箱（SANYO，日本）；倒置电子显微镜（Olympus，日本）；万分之一电子天平（BS 110S），北京赛多利斯天平有限公司；Agilent 1100 LC/MSD SL 型液相色谱/质谱联用仪(Agilent，美国)；Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore Inc.美国)。

丁螺环酮(buspirone，内标，批号0803021，纯度99.9%)北京华素制药股份有限公司提供；槲皮素（quercetin）、异鼠李亭（isorhamnetin）；柽柳黄素（tamarixetin）、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶（美国Sigma公司）；色谱纯甲醇（美国Fisher公司）；DMEM 培养基（美国Gibico公司）；胎牛血清、非必需氨基酸（美国Hyclone公司）；其他试剂均为国产分析纯。

附图1 槲皮素及其甲基代谢产物异鼠李亭和柽柳黄素的HPLC-MS标准色谱图

附图2 槲皮素在Caco-2细胞单层上A→B跨膜转运中B侧溶液中HPLC-MS检测色谱图

1.2 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析

1.2.1 色谱条件：选择Agilent-C18色谱柱(2.1mm×100mm，3.5µm)；柱温为室温；流动相为甲醇∶乙腈（1∶1），含0.1%甲酸；流速为0.2ml/min，进样量为20µl。

1.2.2 质谱条件：电喷雾离子源，雾化气压力30psi，干燥气流速8L/min，干燥气温度35℃，毛细管压力为3000V，四极杆温度99℃，增益为1，峰宽为0.10min，正离子模式，采用选择离子监测（SIM）。槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素的m/z分别为303、317和317，丁螺环酮（内标）为386.2。

1.2.3 标准溶液配制：混合标准储备液配制：精确称取槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素标准品，溶剂为DMSO，配制浓度为3.0mg/ml的母液，取等量槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素母液混合，漩涡震荡使充分混匀，再配制成浓度为1.0mg/ml的混合标准储备液，-80℃备用。

混合标准应用液配制：用采样器精确吸取混合标准储备液，用磷酸缓冲液（PBS溶液）配制成2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100、200、400、1000、2000、4000µg/L，作为混合标准工作液。同时用PBS溶液配制浓度为18µg/L的槲皮素溶液，作为细胞孵育液备用。

内标溶液的配制：精确称取丁螺环酮5mg，用乙腈配制成1.0µg/L的标准储备液，用流动相稀释为20µg/L，作为标准应用液备用。

1.2.4 标准曲线绘制：精确量取上述各浓度混合标准应用液和内标丁螺环酮标准应用液各200µl，漩涡振荡30s使充分混合，3000r/min离心3min，取上清液，20µl进样，LC/MS测定。以各标准物浓度为横坐标，各标准物与内标丁螺环酮的峰高比值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 细胞培养条件和方法Caco-2细胞株购自ATCC，代数在40～50代之间，采用DMEM高糖培养基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺及青霉素-链霉素双抗液）、置于37℃、5%CO2、90%相对湿度下培养。

1.3 细胞培养样品制备与测定 实验前以37℃PBS液（pH7.2）浸泡接种在12孔Millicell板上的细胞15min，轻微冲洗除去细胞表面附着物。在顶侧（A）加入浓度为18µg/L的槲皮素溶液600µl，基底侧（B）加入空白PBS液（pH7.2）1200µl，n=3，放入37℃、5%CO2、90%相对湿度的培养箱中孵育150min，于B侧采样50µl，精确加入等量内标溶液并充分混匀，20µl直接进样测定。

2 结果

2.1 标准谱图 通过优化条件，槲皮素、异鼠李亭、柽柳黄素的保留时间tR分别为2.976min、5.063min、10.951min，丁螺环酮保留时间tR为1.585min，细胞孵育液中实测样品各化合物保留时间稍有变化，见附图1。

2.2 标准曲线 槲皮素、异鼠李亭、柽柳黄素在1.0～1000µg/L范围内线性关系良好，回归方程依次为：Y=0.0209891X+0.002801，r=0.99996；Y=0.0153413X-0.0005867，r=0.99955；Y=0.0175301X-0.0004946，r=0.99983。

附表 槲皮素孵育150min B侧槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素的测定(n=3)

2.3 最低检测限 槲皮素、异鼠李亭、柽柳黄素最低检测限均为1.0µg/L。

2.4 细胞培养样品 由附表可知，在目标峰保留时间左右，细胞孵育液中无杂质峰干扰样品测定。细胞孵育液测定结果表明，槲皮素在A→B跨膜转运中，在Caco-2细胞单层基底侧（B），可以检测到槲皮素原形。同时B侧溶液中可以检测到槲皮素的甲基化代谢产物异鼠李亭和柽柳黄素。其中，3'-OH位置甲基化产物异鼠李亭约是4'-OH位置甲基化产物柽柳黄素的2倍左右。

3 讨论

槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素的HPLC和HPLC-MS/MS测定方法已有报道，在同一溶液体系中同时测定槲皮苷、槲皮素、异鼠李亭和柽柳黄素的HPLC-MS方法也有报道[4]。但由于槲皮素为脂溶性，槲皮苷为水溶性，实现同一体系中同时测定二者的同时，也会损失槲皮素的测定精度。文献报道，槲皮素在肠道吸收和代谢过程中会发生脱糖基和进一步的代谢反应，如甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化等反应。但由于槲皮素在体外环境中不稳定，在有氧条件下极易发生氧化等反应[5]，因此，实验样品在检测前的处理方法会对测定结果产生很大的影响。以往文献中测定槲皮素及其甲基代谢产物一般采用结构相似的类黄酮物质做内标[6]，但类黄酮物质结构不稳定，体外环境下易氧化降解，因此，选择一个稳定的内标对考察槲皮素及其代谢产物的含量很重要。丁螺环酮在常温下稳定，室温下放置72小时、4℃放置1周，测定值的标准偏差均不超过5%，与文献报道一致[7]。因此，本实验采用丁螺环酮做内标，解决了同类物质不稳定对实验结果的影响，在此基础上建立了可以同时测定细胞培养体系中上述3种化合物的HPLC-MS定量检测方法。

本研究选择Agilent-C18色谱柱（2.1mm×100mm，3.5µm），并考察了不同流动相体系对检测结果的影响。结果发现，在甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇+乙腈（1∶1）[8]等流动相体系中，三种化合物和内标物质均分离良好，但在甲醇+乙腈（1∶1）流动相体系中干扰较小，ESI离子化效果较好，因此流动相选择甲醇+乙腈（1∶1）。

本研究发现，异鼠李亭和柽柳黄素在正、负离子监测模式下离子化效率均佳，槲皮素和丁螺环酮在正离子检测模式下离子化效率优于负离子检测，因此选择正离子检测。在ESI(+)离子化方式下，槲皮素、异鼠李亭、柽柳黄素生成的[M+H]+准分子离子峰分别为m/z303、m/z317和m/z317，丁螺环酮为386.2。

在以往的研究中，样品处理大多选用提取、挥干、复溶或酶解等方式，以达到提高待测样品浓度的目的。但由于槲皮素及其代谢化产物物特殊的化学结构，在体外环境下极不稳定，给样品处理造成极大困难，同时由于槲皮素的大部分代谢产物均没有标准品，且含量甚微，因此样品处理过程对研究结果的影响很大。

本方法采用细胞培养液经一倍稀释直接进样测定，不仅使样品处理更简单易行，同时也减少了样品处理过程对测定结果可能产生的不利影响。从本研究的实验样品测定结果分析，槲皮素可以完整分子形式透过Caco-2 细胞单层，同时在跨膜转运过程中会发生进一步的代谢转化，其中，3′-OH 位置的甲基化反应较4′-OH位置更广泛[9]。

综上所述，本研究建立的同时测定细胞孵育体系中槲皮素及异鼠李亭和柽柳黄素的HPLC/MS测定方法，灵敏度高，样品处理方法简单，解决了因常规样品处理过程耗时、复杂以及对不稳定化合物测定结果的影响，且与高效液相色谱比较，大大提高了检测的灵敏度。