陈瑞晗 曹静桦 方永煌 黄国杰 董艳芬 梁燕玲 吕竹芬

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

乌榄(Canarium Pimela Koening)是橄榄科常绿大乔木，其根叶具有舒筋活络、祛风除湿、清热解毒、消肿止痛等功效。课题组前期实验研究发现乌榄叶水提物具有快速降压作用和减慢心率、降低心脏耗氧量、维持心功能、舒张血管平滑肌等作用〔1～6〕，本文旨在通过不同方法建立心律失常(AC)模型，观察乌叶对AC的药效作用。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级昆明小鼠60只，雌雄各半，体重18～20 g，购自广东省动物中心。SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供。仪器：PcLab生物医学信号采集处理系统(北京薇信斯达科技发展有限责任公司)；HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。药物：乌叶由本课题组制备，药材其采集点为中山地区。称取乌榄叶，加入蒸馏水加热回流2 h，滤过，收集药液，剩余药渣重新加水，再次加热回流，滤过，收集药液，合并两次药液，在60℃的烘箱中烘干，打粉保存备用，实验用药时用生理盐水配液。维拉帕米注射液(5 mg/2 ml)，批号：国药准字H31021343，上海禾丰制药有限公司；盐酸维拉帕米片(40 mg/片)，批号：140101，广东华南药业集团有限公司；氯化钡粉剂(BaCl299%)，批号：10326-27-9，深圳市科天化玻仪器有限公司生产。

1.2方法

1.2.1对BaCl2诱发小鼠AC的影响 将小鼠随机分为5组，每组12只。用药组分为维拉帕米组(0.065 g/kg)、乌叶高剂量组(1.6 g生药/kg)和低剂量组(0.16 g生药/kg)，每天以0.2 ml/10 g剂量灌胃1次，空白对照组和模型组以等容量生理盐水灌胃，灌胃前3 h内禁食不禁水，连续28 d。于第27天灌胃后禁食16 h，第28天灌胃1 h后，用4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉。利用Pclab生物信号采集处理系统，记录标准Ⅱ导联正常心电图，模型组和各用药组5 min后尾静脉注射0.1%BaCl2(2 mg/10 g)诱发AC〔7〕，空白对照组注射等容量生理盐水，观察和记录心电图30 min。

1.2.2对大鼠心肌缺血再灌注性AC的影响〔8,9〕将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、乌叶组(1 g生药/kg)、维拉帕米组(5 mg/kg)，每组10只。以2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，从口腔经咽喉行气管插管，连接呼吸机维持呼吸(呼吸机实验参数：潮气量为50 ml/kg，呼吸频率为60次/min，呼吸比为2∶1)。开胸、暴露心脏，于左心耳下方2 mm处沿冠状动脉用缝合针穿一根线，待心电图稳定后开始全程恒速股静脉滴注药物(1～2 d/min)，假手术组和模型组滴注生理盐水，给药8 min后，将小胶管与冠状动脉一起结扎，7 min后抽离小胶管，解开结扎线，连续记录标准Ⅱ导联心电30 min。

1.2.3观察指标 记录30 min的期前收缩(PB)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)的次数和持续时间及心率变化，并进行AC评分。AC评分=lg PB次数+2(lg VT次数)+2(lg VF次数)+lg VF持续时间。

1.3统计方法 应用SPSS21.0统计软件进行单因素方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1对BaCl2诱发小鼠AC的影响 空白对照组无AC发生。模型组出现明显的AC，各项指标与空白对照组比较差异有统计学意义，死亡率高(P<0.01)，提示建模方法有效。与模型组比较，乌叶高剂量组、低剂量组均能显著减少VT发生率和VF次数，缩短VT、VF的持续时间和死亡率(P<0.05，P<0.01)，与低剂量组比较，高剂量组显著降低VT发生率和持续时间(P<0.05)，降低PB次数、AC评分和死亡率(P<0.05)，主要表现为室性早搏二联律，提示乌叶具有较强的抗AC作用，且呈一定量效关系，其作用效果与维拉帕米相近或略强，见表1。

表1 乌叶对BaCl2诱发小鼠AC的影响

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与乌叶低剂量组比较：3)P<0.05；表2同

2.2对大鼠心肌缺血再灌注性诱发AC的影响 与假手术组比较，模型组出现明显的PB、VT、VF，心率减慢显著，各项指标差异均有统计学意义(均P<0.01)，提示结扎大鼠冠状动脉至心肌缺血再灌注损伤诱发AC建模成功。与模型组相比，乌叶组可显著减少VF次数、缩短VF持续时间、AC持续时间及减缓心率降低(P<0.05)。维拉帕米作用效果与其相似，明显降低PB次数和AC评分(P<0.05，<0.01)。见表2。

表2 乌叶对大鼠心肌缺血再灌注性诱发AC的影响

3 讨 论

BaCl2诱导的AC与多种离子流相关，静脉注射BaCl2可增加心肌蒲氏纤维Na+内流，提高最大舒张期去极化的速率；可使心肌细胞外Ca2+内流而诱发迟后除极；Ba2+、K+通道的开放阻断剂，竞争性地抑制K+流出，提高自律性，从而引发AC〔10〕。

缺血再灌注AC是心肌在缺血一定时间后再恢复血流灌注而引起再灌注区域的心肌细胞能量不足或缺乏，心肌细胞离子通道电流失衡〔11〕，从而出现再灌注性AC。研究发现钙超载和生成氧自由基与再灌注性AC(RPA)密切相关，在缺血缺氧的情况下，细胞代谢转为糖酵解，产生大量乳酸，使细胞内H+增加，提高Na-H交换，抑制Na-Ca2+交换，导致细胞内Ca2+积聚、超载，在再灌注时逐渐加重，同时产生大量的氧自由基。钙超载和氧自由基可损害线粒体，减少ATP生成，同时引起心肌细胞除极，动作电位波幅降低，诱发平台期电位的振荡，导致AC〔12～14〕。另外有研究表明短暂性心肌缺血也可能诱发VF，尤其是在应激或运动状态下〔15〕。所以本实验采用心肌缺血再灌注致AC法，即结扎大鼠冠状动脉左前降支，引发急性心肌缺血，再解开结扎线，建立AC模型，用以进一步观察乌榄叶对AC的拮抗作用。

维拉帕米是Ca2+拮抗剂药物，可结合在选择性过滤器的细胞内侧孔的中心腔中，物理地阻断电压门控Ca2+通道〔16〕，上述实验结果表明，维拉帕米均能显著性拮抗小鼠尾静脉注射BaCl2和结扎大鼠冠状动脉方法诱导的AC。乌叶作用效果与维拉帕米相似或略强，能显著减少PB次数，缩短VT、VF和AC的持续时间，降低AC评分和死亡率，具有明显的抗AC作用，为乌榄叶的药效作用提供了新思路。研究发现，乌榄已有的化学成分，挥发性成分以单萜类为主，有一定的抗氧化活性和清除自由基的能力〔17〕。董艳芬等〔2,18〕实验表明，乌叶能有效阻断细胞膜受体操纵性钙通道，抑制外钙内流从而舒张血管平滑肌，说明乌叶抗AC作用的机制可能是通过阻断钙通道，抑制心肌细胞外钙内流，降低其自律性，减慢房室结传导速度，从而延长不应期，进而拮抗AC。但其具体机制尚不明确，有待进一步研究。

目前，治疗AC主要以药物为主，化学药物虽然具有作用迅速，疗效确切等特点，但都具有一定的不良反应，如β受体阻断剂、钙拮抗剂均可引起和加重房室传导阻滞，限制其长期应用。而近几年相对于化学药物、天然药物抗AC的价值逐渐得到了认可，中医药治疗因能够对病人进行整体调整，具有多靶点、多层次的干预效果而具有一定优势〔19，20〕。乌榄叶已被证明具有较强的舒张血管、降压和减慢心率作用〔1～6〕，因此，乌榄叶具有广泛的应用开发前景和价值，进一步深入研究其抗AC的有效成分及作用机制具有重要意义。