刘志广 刘 芬 韩江红

(新乡市中心医院胸瘤一科，河南 新乡 453000)

EffectsofsiRNAinterferenceonROBO1geneexpressiononcellcycle,proliferationandrelatedproteinsinesophagealcarcinoma

LIUZhi-Guang,LIUFen,HANJiang-Hong.

No.1DepartmentofChestTumor,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of siRNA targeting interference roundabout, axon guidance receptor, homoloh 1(ROBO1) gene expression on proliferation and cell cycle of esophageal cancer EC109 cells and its possible mechanism.MethodsEsophageal cancer EC109 cells were randomly divided into blank group, control group and SiRNA-ROBO1 group. Negative siRNA and siRNA-ROBO1 were transfected into EC109 cells by liposome. The expression of ROBO1, nuclear related antigen Ki-67(Ki-67), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and CyclinD1 protein were detected by Western blot. The proliferation activity of the cells was detected by CCK-8 assay and the cell cycle changes of EC109 were detected by flow cytometry.ResultsAfter interfering with ROBO1 expression, the expression of ROBO1 protein in EC109 cells was significantly lower than that in the blank group(P<0.05), and the cell proliferation activity was significantly decreased(P<0.05). The cells in G0/G1 phase were significantly increased(P<0.05), and in G2/M phase were significantly decreased(P<0.05). The expression levels of Ki-67, PCNA and CyclinD1 in siRNA-ROBO1 group were significantly lower than those in the blank group(P<0.05).ConclusionsROBO1 may inhibit the proliferation of esophageal cancer cells by affecting the proliferation and cycle-associated protein levels of esophageal cancer cells and arresting the cell cycle in G0/G1 phase.

【Keywords】 Esophageal cancer; siRNA; ROBO1; EC109

目前，国内外对于食管癌的早期诊断和治疗并未寻找到有效的方法，其五年生存率仍较低〔1〕。食管癌对人类的健康产生极大的危害，目前的治疗手段是手术、放疗、化疗单独或者联合使用，但副作用较大，花费高，患者的预后较差，无法从根本上阻碍肿瘤的生长，因此需要我们不断探索、寻找新的治疗手段〔2〕。随着科学技术的快速发展，促进人类对基因领域的相关研究，使人们可从基因水平阐释肿瘤的发病机制。基因的变异、突变、表达量的变化等对肿瘤的演进均发挥重要作用〔3～5〕。目前，食管癌的发病机制尚不完全清楚，所以研究食管癌的发生、发展作用机制具有重大意义，探索新的诊断标志物以及治疗的靶基因，为降低食管癌的死亡率以及发病率提供实验基础。本文通过小RNA干扰技术(siRNA)干扰食管癌EC109细胞中轴突导向受体蛋白(ROBO)1表达，研究对EC109细胞增殖、周期及相关蛋白的影响，探索ROBO1在食管癌发生发展的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 人食管癌细胞系EC109购自美国Allcells公司，RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清、青-链霉素、Opti-MEM购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自青岛捷世康生物科技有限公司，LipofectamineTM2000试剂购自美国Invitrogen公司，siRNA、细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，细胞周期蛋白(Cyclin)D1兔抗人单克隆抗体购自美国CST公司，细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)单克隆抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin单克隆抗体购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自北京鼎国生物公司。细胞恒温培养箱购自德国Heraeus公司，酶标仪购自美国BIO-RAD公司，台式低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2细胞的培养 将人食管癌细胞EC109培养基于含10%胎牛血清、1% 100 U/ml青-链霉素的RPMI1640培养基中，置于含有5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。待细胞生长浓度覆盖培养瓶底约80%时，加入胰酶，显微镜中观察自爆形态逐渐变为椭圆，加入新鲜RPMI1640培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，以1∶3或1∶4的比例制成单细胞悬液，37℃常规继续培养。

1.3细胞的转染 选择对数期食管癌细胞，转染前24 h常规消化细胞，加入无胎牛血清和双抗的RPMI-1640培养基，将细胞密度调整为1×105个/孔，加入24孔板中，待细胞密度至50%～70%时，将细胞分为空白组、对照组(转染阴性对照siRNA)、siRNA-ROBO1组。吸取50 μl Opti-MEM稀释脂质体LipofectamineTM2000(2 μl/孔)，室温静置5 min；采用无RNA酶水将siRNA-ROBO1稀释为2 μmol/L；将稀释的脂质体与siRNA-ROBO1混合均匀，室温静置20 min，形成脂质体-siRNA-ROBO1转染复合物；吸取10 μl转染复合物加入各孔细胞中，前后摇动混匀，置于37℃下继续培养6 h，更换为含10%胎牛血清RPMI1640培养基继续培养48 h，Western印迹测定转染效果。

1.4细胞增殖活力的检测 将食管癌细胞接种至6孔板中，待细胞密度至50%～70%时，将细胞分为空白组、对照组、siRNA-ROBO1组，转染细胞，方法同1.3；吸取100 μl细胞悬浮液加入96孔板中，使每孔细胞密度为(1～3)×103个，每组3个复孔，常规培养48 h，每孔加入10% CCK-8溶液，振荡混匀，培养箱中培养1.5 h，测定细胞在450 nm波长下的吸光值(OD450 nm值)。

1.5细胞周期检测 胰酶消化转染后48 h的食管癌细胞，加入1 ml预冷的乙醇，4℃固定过夜，弃去乙醇，PBS液洗涤，加入200 μl 1 g/L RNaseA，室温孵育30 min，吸取500 μl PI溶液，4℃避光孵育30 min，置于流式细胞仪中检测。

1.6Western印迹检测细胞中Ki-67、PCNA、CyclinD1蛋白的表达水平 胰酶消化转染后48 h食管癌细胞，收集细胞，加入细胞裂解液，充分振荡，冰上裂解15 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上层，根据BCA蛋白质浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。

清洗玻璃板、梳子、电泳装置，晾干，配置10 ml 10%分离胶和5 ml 5%浓缩胶。将分离胶缓慢注入玻璃板，加至玻璃板上边沿约3 cm，加入3 ml异丙醇覆盖分离胶，室温放置40 min，弃掉异丙醇，在分离胶上边沿0.5 cm处缓慢注入浓缩胶，插入梳子，防止气泡的出现。取30 μg蛋白样品溶于等体积5×上样缓冲液，100℃变性5 min。80 V电泳至溴酚蓝进入分离胶，调整电压至110 V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶边缘。根据目的蛋白分子量的大小切下分离胶，组装转膜装置，90 V，280 mA冰水中电泳60 min。Tris-Hcl缓冲盐溶液+Tween(TBST)清洗转膜后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入含封闭液的平皿中，摇动封闭2 h，加入稀释的一抗，摇床上孵育1.5 h，4℃过夜，TBST洗膜3次×10 min，加入二抗，摇床上孵育1.5 h，TBST洗膜3次×10 min，滴加化学发光试剂A液、B液，避光孵育3 min，暗室中曝光，成像仪中成像。

1.7统计学分析 采用SPSS22.0软件资料进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1Western印迹测定转染效果 siRNA-ROBO1组ROBO1蛋白表达量(0.249±0.036)较空白组显著降低(P<0.05)，对照组细胞中ROBO1蛋白水平(0.795±0.078)与空白组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图1，表1。

图1 EC109细胞转染后ROBO1蛋白的表达量

2.2ROBO1表达量降低对食管癌细胞增殖活力的影响 siRNA-ROBO1组细胞的增殖活力(0.302±0.045)较空白组(0.758±0.073)显著降低(P<0.05)，对照组细胞的增殖活力(0.726±0.084)与空白组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3ROBO1表达量降低对食管癌细胞细胞周期的影响 siRNA-ROBO1组G0/G1期细胞较空白组显著增加(P<0.05)，G2/M期细胞显著降低(P<0.05)，S期细胞变化不明显，对照组细胞周期与空白组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.4ROBO1表达量降低对食管癌细胞中相关蛋白水平的影响 siRNA-ROBO1组PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白表达量较空白组显著降低(P<0.05)，对照组细胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平与空白组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2，表2。

表1 ROBO1表达量降低对食管癌细胞细胞周期的影响

与空白组比较：1)P<0.05，下表同

图2 ROBO1表达量降低对食管癌细胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平的影响

组别PCNA/β-actinKi-67/β-actinCyclinD1/β-actin空白组0.628±0.0560.466±0.0450.458±0.042对照组0.619±0.0620.429±0.0630.469±0.053siRNA-ROBO1组0.230±0.0251)0.185±0.0211)0.158±0.0241)F值61.10632.60354.431P值0.0000.0010.000

3 讨 论

ROBO1属于免疫球蛋白超家族，是SLIT家族成员的跨膜受体，主要在神经系统中分泌，对轴突导向发挥重要作用〔6～9〕。近年研究表明，ROBO1与肿瘤的发生、发展相关。研究证实，ROBO1在肝癌组织中的表达量上调，促进肝癌细胞增殖，诱导血管内皮细胞新血管形成〔10〕。在自发肠腺瘤或SLIT2转基因小鼠模型中，ROBO1在肠道肿瘤组织中高表达，且可通过调控上皮-间质转化相关因子的表达激活Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路，从而促进肿瘤的发生〔11〕。但是，在不同中的肿瘤组织中ROBO1发挥不同的作用。ROBO1在前列腺癌中通过与相应的细胞因子结合间接激活钙黏蛋白E和β-catenin信号通路促进前列腺癌细胞迁移〔12〕。在胆管癌中，通过免疫组化检测胆管癌组织中ROBO1的表达量，结果发现ROBO1的表达水平与胆管癌患者的预后显著相关，且ROBO1能阻碍胆管癌细胞的转移能力〔13〕。研究发现，ROBO1在食管癌中异常表达，在食管癌的发生、发展的过程中发挥作用〔14〕。

本实验表明转染siRNA-ROBO1的食管癌细胞中ROBO1蛋白的表达量明显降低，使细胞阻滞在G0/G1期发挥抑制食管癌细胞增殖的的作用。

Ki67、PCNA与肿瘤细胞的增殖密切相关。研究表明，Ki67在胃癌、肝癌及肺癌等恶性肿瘤中均高表达，在肿瘤的发生、发展过程以及组织转移、浸润、预后发挥重要作用〔15～17〕。Ki67的表达量对于肿瘤细胞的增殖、有丝分裂、周期具有重要作用，可作为肿瘤细胞的生物学特性及预后的评价指标〔18〕。既往研究认为，PCNA参与肿瘤的发生、发展，在结肠癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达〔19～22〕。PCNA是DNA复制过程中的关键因子，能与细胞内多种因子结合，调控细胞周期、DNA甲基化、DNA的损伤修复过程发挥多种功能。研究表明，PCNA与细胞的增殖、凋亡过程密切相关，其表达量可作为评价肿瘤恶性程度和细胞的增殖能力的指标之一〔23〕。CyclinD1是细胞周期G1/S转换过程中的关键调节因子，在多种肿瘤中的表达量上调，其与恶性肿瘤的程度密切相关〔24〕。本实验结果显示，ROBO1表达量下降抑制细胞中Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白的表达量。因此，推测抑制ROBO1表达可能通过影响细胞增殖相关因子Ki67、PCNA以及细胞周期相关因子CyclinD1的表达降低细胞的增殖能力。综上所述，本实验通过体外实验抑制食管癌细胞中ROBO1表达，发现，食管癌细胞的增殖活性下降，细胞周期阻滞在G0/G1期，表明ROBO1与促进细胞增殖和调控细胞周期有一定关系，提示ROBO1基因在食管癌细胞中具有一定的致瘤性，其作用可能与Ki67、PCNA、CyclinD1的表达量有关。下一步将继续在动物模型中研究ROBO1基因在食管癌中的作用，为探究食管癌的发病机制、靶向基因治疗提供实验依据。