赵 旭 王晓寒 广 东 张 铭

(河南护理职业学院，河南 安阳 455000)

TheeffectofNF-κBonthegrowth,cellcycleandTNF-αsecretionoflungcancercells

ZHAOXu,WANGXiao-Han,GUANGDong,etal.

HenanVocationalCollegeofNursing,Anyang455000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of NF-κB on the growth, cell cycle and secretion of TNF-α in lung cancer cells.MethodsNF-κB inhibitor SN50 was used to treat lung cancer cells, the cell proliferation was tested by MTT, cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry. The content of TNF-α in supernatant of culture liquid was determined by ELISA. Western blot was used to determine the levels of CyclinB1, CyclinD1, cleaved Caspase-3, Bax, NF-κBp65 proteins.ResultsSN50 inhibited the proliferation of lung cancer cells, and with the increasing of SN50 concentration and time.The apoptosis rate of lung cancer cells after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells(P<0.05).The proportion of G2/M in lung cancer cells after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells (P<0.05). The level of TNF-α in lung cancer cell culture solution after SN50 treatment was significantly higher than that of normal lung cancer cells (P<0.05). The levels of CyclinB1, CyclinD1 and NF-κBp65 in lung cancer cells treated with SN50 were significantly lower than those of normal lung cancer cells. The levels of cleaved Caspase-3 and Bax were significantly higher than those of normal cultured lung cancer cells(P<0.05).ConclusionsInhibition of NF-κB signaling pathway could inhibit the proliferation of lung cancer cells, block cell cycle at G2/M stage, induce apoptosis, promote the expressions of cleaved Caspase-3 and Bax, down-regulate the levels of CyclinB1 and CyclinD1 protein.

【Keywords】 NF-κB; Lung cancer; Cell cycle; TNF-α

肺癌的死亡率和发病率均处于恶性肿瘤的首位，早期临床症状不明显，多数患者在确诊时已是晚期。分子靶向治疗、手术治疗等常见的肺癌治疗手段取得了一定进步，但其综合治疗效果仍然不能完全满足需求〔1〕。核因子(NF)-κB是最早发现于成熟B细胞中的转录因子，具有淋巴细胞特异性，其在各种细胞中均有表达，能够调控肿瘤、心血管系统等多种疾病的发生，其在肿瘤中过度激活，其激活后可以促进抗凋亡蛋白的产生发挥肿瘤促进作用〔2,3〕。研究显示，NF-κB和肿瘤坏死因子(TNF)相互作用，共同调控肿瘤的发生，NF-κBp65是NF-κB的一个亚单位，在肺癌中过度表达〔4,5〕。本研究用NF-κB信号通路抑制剂处理肺癌细胞，通过MTT、流式细胞术等方法测定NF-κB对肺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及分泌TNF-α的影响。

1 材料与方法

1.1材料 肺癌细胞LAC购自上海和序生物；NF-κB抑制剂SN50购自美国MedChemExpress；电化学发光(ECL)试剂购自于碧云天；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore；细胞周期测定试剂盒购自美国BD；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度试剂盒购自美国Thermo；NF-κBp65抗体购自美国Cell sigaling Technology；细胞周期蛋白(Cyclin)B1抗体、CyclinD1抗体购自美国Santa Cruz；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Abacm；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国R&D Systems；TNF-α含量测定试剂盒购自上海康朗生物；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自上海Bogoo。

1.2MTT检测细胞增殖 LAC细胞浓度调整为5×104个/ml，种植到96孔板中，每孔中约有4 000个细胞。观察细胞贴壁后，提前设置每个浓度梯度4个重复孔，把原来的细胞培养液吸除后，添加含有SN50的培养液，浓度依次为：0、3、6、12、24、48 μmol/L，分别培养24、48、72 h后取出培养板，在每个孔中依次加入20 μl MTT，继续放在培养箱中孵育4 h。倾斜培养板，把上清液吸除以后，每孔中再加入150 μl二甲基亚砜，低速摇床孵育5 min。把培养板放置于酶标仪上检测490 nm的OD值。

1.3细胞分组处理 LAC细胞分为对照组和SN50组，对照组在实验开始时在培养液中添加0 μmol/L SN50，SN50组添加12 μmol/L SN50。

1.4流式细胞术测定细胞周期 对照组、SN50组细胞分别培养48 h，收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞沉淀洗涤2次，在细胞中加入1 ml、70%的乙醇固定，1 000 r/min离心5 min，用移液枪把上清吸除后，每管中添加0.5 ml PI，充分混合，37℃，避光反应30 min。用流式细胞仪测定各组细胞周期。

1.5Annexin V-FITC/PI法测定肺癌细胞凋亡 对照组、SN50组细胞分别培养48 h，胰蛋白酶消化后，收集细胞，加入500 μl缓冲液，完全混合后，再添加Annexin V-FITC、PI各5 μl，在室温中孵育结合15 min。立即用流式细胞仪测定各组细胞凋亡水平。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肺癌细胞分泌的TNF-α含量 对照组、SN50组细胞分别培养48 h，收集各组培养液上清，用ELISA测定TNF-α水平，操作步骤参照TNF-α含量测定试剂盒。

1.7Western印迹测定肺癌细胞中CyclinB1、CyclinD1、酶切Caspase-3、Bax、NF-κBp65蛋白水平 对照组、SN50组细胞分别培养48 h，用冰预冷后的PBS洗涤后，用移液枪把PBS去除，按照每个6 cm的培养皿中添加200 μl裂解液裂解细胞(冰上30 min)，把细胞刮下并收集，4℃，12 000 r/min离心10 min。BCA测定各组蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳：每个蛋白样品上样60 μg约20 μl，在100℃与上样缓冲液混合煮沸5 min，在积层胶中用80 V电压电泳，在分离胶中用120 V恒压电泳，溴酚蓝染料进入凝胶的最底部时停止电泳。转膜：90 V恒压、转膜90 min，把蛋白转移到PVDF膜上。把膜放在5%脱脂奶粉中孵育1 h，再用TBST洗2次后，放在稀释好的一抗(CyclinB1按1∶800稀释、CyclinD1按1∶800稀释、酶切Caspase-3按1∶1 000稀释、Bax按1∶800稀释、NF-κBp65按1∶800稀释)中在4℃反应过夜，再用TBST洗2次后，再把膜放在稀释好的二抗(1∶2 000稀释)中室温结合2 h。用ECL发光以后，曝光仪曝光，Quantity One定量分析蛋白，GAPDH为内参。

1.8统计分析 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1NF-κB抑制剂降低肺癌细胞增殖能力 0、3、6、12、24、48 μmol/L NF-κB抑制剂SN50作用后肺癌细胞24 h的OD值依次为：0.46±0.02、0.39±0.04、0.33±0.02、0.27±0.01、0.22±0.02、0.15±0.01，48 h的OD值依次为：0.84±0.09、0.65±0.05、0.58±0.06、0.44±0.04、0.36±0.03、0.23±0.04，72 h的OD值依次为：1.17±0.08、1.02±0.06、0.85±0.07、0.72±0.05、0.62±0.04、0.41±0.03；3、6、12、24、48 μmol/L的SN50作用后细胞OD值明显低于0 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。6、12、24、48 μmol/L作用后细胞OD值明显低于3 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。12、24、48 μmol/L作用后细胞OD值明显低于6 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。24、48 μmol/L作用后细胞OD值明显低于12 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。48 μmol/L SN50作用后细胞OD值明显低于24 μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。 NF-κB抑制剂在24、48、72 h均能够抑制肺癌细胞的增殖，后续选用作用时间为48 h继续研究。计算SN50在48 h的半数抑制浓度约为12 μmol/L，选用12 μmol/L的SN50作用肺癌细胞48 h做后续研究。

2.2NF-κB抑制剂诱导肺癌细胞凋亡 SN50组细胞凋亡率〔(35.49±4.61)%〕明显高于对照组〔(9.17±0.82)%，t=9.736,P<0.05〕。见图1。

2.3NF-κB抑制剂阻滞肺癌细胞周期 对照组、SN50组细胞G0/G1比例为(63.50±4.15)%、(41.28±3.85)%，G2/M比例为(14.83±1.32)%、(35.88±3.64)%，S期比例为(21.67±1.86)%、(22.84±2.40)%。SN50组细胞G0/G1比例明显低于对照组，G2/M比例明显高于对照组，差异有统计学意义(t=6.799,9.416；均P<0.05)，而S期比例差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4NF-κB抑制剂诱导肺癌细胞分泌TNF-α SN50组细胞分泌的TNF-α水平〔(6.47±0.52)μg/ml〕明显高于对照组〔(3.15±0.30)μg/ml〕，差异有统计学意义(t=9.579,P<0.05)。

图1 抑制NF-κB后肺癌细胞凋亡情况

2.5NF-κB抑制剂减少CyclinB1、CyclinD1表达并促进酶切Caspase-3、Bax表达 SN50组细胞中CyclinB1、CyclinD1、NF-κBp65水平明显低于对照组，酶切Caspase-3、Bax水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表1。

图2 Western印迹检测细胞中CyclinB1、CyclinD1、酶切Caspase-3、Bax、NF-κBp65水平

组别CyclinB1CyclinD1酶切Caspase-3BaxNF-κBp65对照组0.84±0.091.23±0.110.45±0.050.59±0.080.64±0.05SN50组0.36±0.050.42±0.061.10±0.091.45±0.160.21±0.03t/P值8.075/<0.0511.197/<0.0510.935/<0.058.327/<0.0512.773/<0.05

3 讨 论

正常情况下，NF-κB以二聚体的形式存在于细胞质内，NF-κBp65是NF-κB作用最为重要、分布最为广泛的亚单位〔6,7〕。NF-κB与人类肿瘤发生有关，并且与肿瘤的临床分期、发展、预后等具有相关性，其诱导肿瘤发生的作用机制主要与抗肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、影响细胞内DNA复制等有关，另外，肿瘤微环境对肿瘤组织中NF-κB的激活也具有重要作用〔8,9〕。在淋巴系肿瘤中发现NF-κB过度激活，而降低NF-κB激活后可以抑制癌细胞的恶性增殖〔10〕。裸鼠基因敲除NF-κB后，肝脏细胞过度凋亡，出现退行性病变〔11〕。在Hela和Jurkat细胞中发现，激活NF-κB后可以降低TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡〔12〕。厚银环等〔13〕研究表明，NF-κB在肺癌中的阳性率超过60%，而在非肺癌组织中的阳性率只有15%左右。本研究用NF-κB信号通路抑制剂处理肺癌细胞，肺癌细胞的增殖能力下降，说明抑制NF-κB可以抑制肺癌细胞增殖。进一步用流式细胞术测定细胞周期和细胞凋亡情况，结果说明NF-κB抑制后可以阻滞肺癌细胞周期，诱导肺癌细胞凋亡，这些与上述实验报道相符合，均说明NF-κB抑制以后可以阻碍肿瘤的发展。

NF-κB还具有调控肿瘤细胞生长的作用，可以通过作用于周期蛋白，影响肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞的增殖〔14〕。CyclinD1、CyclinB1是NF-κB的靶基因，NF-κB激活后可以促进CyclinD1、CyclinB1的表达，影响肿瘤细胞周期〔15,16〕。有研究显示，NF-κB可以调控胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌等多种癌细胞的细胞周期，影响癌细胞中周期相关蛋白的表达〔17～19〕。Caspase级联反应与多种细胞的凋亡有关，几乎参与所有细胞的凋亡过程，细胞凋亡信号发出后，Caspase被激活，发生类似于“瀑布”的级联反应，Caspase-3位于Caspase凋亡反应的最末端，其被剪切后形成具有活性的酶切Caspase-3，最终诱导细胞凋亡的发生〔20〕。Bax是除了Caspase蛋白家族之外的另一个与细胞凋亡密切相关的Bcl-2蛋白家族成员之一，可以与Caspase共同作用诱导细胞凋亡发生〔21〕。本实验结果表明，NF-κB抑制后肺癌细胞中酶切Caspase-3、Bax蛋白水平升高，而细胞中CyclinD1、CyclinB1蛋白水平降低，与NF-κB抑制剂诱导肺癌细胞凋亡和阻滞细胞周期结果相符合。

TNF-α在血管生成、细胞迁移、免疫激活等方面具有重要作用，在肿瘤细胞的生长、凋亡等过程中也具有调控作用〔22〕。研究显示，TNF-α可以诱导肿瘤细胞凋亡，阻碍肿瘤细胞生长，具有抗肿瘤作用〔23〕。夏启松等〔24〕研究显示，大黄素抑制肺癌细胞体外增殖能力的同时诱导肺癌细胞分泌TNF-α。叶小卫等〔25〕研究显示，亚砷酸在诱导肺癌细胞凋亡的同时促进肺癌细胞表达TNF-α。本研究结果显示，NF-κB抑制剂可以诱导肺癌细胞分泌TNF-α。

综上，下调NF-κB激活可以抑制肺癌细胞生长，诱导Caspase-3、Bax介导的细胞凋亡，下调CyclinD1、CyclinB1蛋白表达阻滞细胞周期，促进细胞分泌TNF-α，这明确了抑制NF-κB对肺癌细胞生长、凋亡及细胞周期的作用，为以后研究NF-κB在肿瘤发病机制中的作用提供了参考依据。