许雅宁，李江飞，孙 琦，邹 东，詹春怡，周亚军

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林长春 130012）

河蚌是软体动物蚌科一类的总称，在我国分布广泛、价格低廉，但该资源并未得到充分利用[1-2]，少部分用作食材，多数作为废弃物直接丢弃。河蚌肉具有高蛋白、低脂肪的特点，含有矿物质、人体必需氨基酸和微量元素等[3]，对人体具有良好保健功效[4]。通过Caglak A E等人[5]的研究发现，河蚌肉与传统肉类相比热量更低、脂肪含量更低、所含矿物质更多，所以是很好的蛋白粉制取原料。

人们对河蚌蛋白粉提取工艺有着很长时间的摸索，张艳萍等人[6]用碱法提取了贻贝中的蛋白质并且除去了其中的蛋白多糖，贺琴[7]通过高压脉冲电场对河蚌蛋白进行了提取，但这些传统方法，均存在着对原料有所损伤、耗能较高、技术复杂等缺陷。近年来，因为有着环境友好、反应条件温和的优点[8]，酶解法越来越多地被人们应用于食品工业中，但基本上都是利用单一酶进行研究。闫永等人[9]利用木瓜蛋白酶进行河蚌肉酶解软化工艺的探讨。徐兆刚等人[10]选用中性蛋白酶利用响应面法进行河蚌酶解工艺的优化并制备河蚌蛋白抗氧化肽。宋亮等人[11]采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等进行河蚌酶解最优条件的探索。

但是，酶解的反应速率缓慢，大大限制了该项工艺在实际生产中的应用。增加酶促反应速率的方法有很多种，比如固定化[12]、化学修饰法[13]，近年来，超声辐照和微波催化广泛用于加快反应速率，其中已经成功应用于生产醇类[14]和生物柴油[15]。

试验以河蚌肉为原料，采用超声波-微波酶解（木瓜蛋白酶等）提取蛋白，并优化酶解工艺，为高营养价值河蚌肉蛋白粉的研制和开发提供理论依据和借鉴参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

松花江野生被角无齿蚌，购于长春市扶余市长春岭镇；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶，南京奥多福尼生物科技有限公司提供；氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SZ-22型打浆机，广州旭众食品器械有限公司产品；JJ200型电子天平，常熟市双杰测试仪器场产品；PHSJ-4A型试验pH计，上海禹昂自动化科技有限公司产品；THZ-98A型恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司产品；SHJ-4B型恒温磁力搅拌水浴锅，常州高德仪器制造有限公司产品；TGL-16gR型高速台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；MAS-II型微波反应仪，上海新仪微波化学科技有限公司产品；SP-756P型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；FD-1C-80型冷冻干燥机，北京博医实验仪器有限公司产品等。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

河蚌用清水养2～3 d，去除外壳、蚌泪和内脏组织之后洗净、淋干，用胶体磨绞碎，在-18℃条件下冷冻备用，作为待试样品。

1.3.2 河蚌肉基本组分分析

测定原料的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分。详见1.4.3。

1.3.3 最佳蛋白酶的筛选

参照GB/T 23527—2009中的方法测定所用酶的酶活力。各取5 g样品，在每种酶的最适温度、最适pH值下，酶添加量为4 000 U/g，料液比为1∶12，恒温振荡（150 r/min） 酶解4 h，结束后迅速水浴灭酶 （90℃，10 min），离心 （4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入双缩脲试剂，30 min后采用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测定吸光度。计算蛋白提取率。从经济和酶解效果等多方面考虑，筛选出最适宜的酶解用酶。

不同蛋白酶的最适反应条件见表1。

表1 不同蛋白酶的最适反应条件

1.3.4 酶解提取河蚌蛋白

以酶添加量、pH值、酶解温度、料液比、酶解时间研究其对蛋白提取率影响的变化规律。取5 g样品，酶添加量4 000 U/g，料液比1∶12，在酶解温度55℃，酶解pH值6.5的条件下酶解4 h，结束后迅速水浴灭酶（90℃，10 min），离心（4 000 r/min，10 min） 取上清液，加入双缩脲试剂，30 min后采用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测定吸光度；计算蛋白提取率，固定其他条件，分别探讨不同酶添加量、料液比、酶解温度、酶解pH值、酶解时间对河蚌蛋白提取率的影响。

酶解提取河蚌蛋白单因素与水平设计见表2。

表2 酶解提取河蚌蛋白单因素与水平设计

根据单因素试验结果选取适宜条件，以酶添加量、酶解pH值、酶解温度、酶解时间为因素进行四因素三水平响应面优化试验。

1.3.5 超声波-微波酶解

取10 g样品，以优化得到的条件配制原料液，均质2 min，于超声波-微波复合反应仪下用不同微波功率、微波时间处理，根据单因素试验结果选取适宜条件，增加酶添加量为变量进行L9（34）正交试验。酶解操作同1.3.4。

超声波-微波酶解提取河蚌蛋白单因素与水平设计见表3。

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白质量浓度及标准曲线的测定

酶解液离心后取上清液1 mL于试管中，加入4 mL双缩脲试剂，空白调零，30 min后采用紫外可见分光光度计于波长540 nm处测定吸光度。根据牛血清白蛋白标准曲线（Y=0.044 8X+0.006，R2=0.998 3）计算对应的蛋白质量浓度。

1.4.2 蛋白提取率的计算

式中：C——测得的可溶性蛋白质量浓度，mg/mL；

A——稀释倍数；

V——蛋白提取液体积，mL；

m——河蚌肉的质量，g；

w——河蚌蛋白含量，g/g。

1.4.3 河蚌肉基本营养成分测定

水分，采用直接干燥法测定[17]。；粗蛋白，采用凯氏定氮法测定[18]；粗脂肪，采用索氏抽提法测定[19]；灰分，采用坩锅法测定总灰分[20]。

2 结果与分析

2.1 河蚌肉基本组分分析

河蚌肉基本组分分析见表4。

表4 河蚌肉基本组分分析/%

从表4中可以看出，河蚌肉确实是一种高蛋白、低脂肪的优质蛋白质，其中粗蛋白含量为7.51%左右，约为河蚌肉干料成分的53.26%，与张缓等人[16]测出的51.07%相近，因此河蚌肉是优质的蛋白酶解原料。

2.2 最佳蛋白酶的筛选

不同蛋白酶的酶活力值和对河蚌肉蛋白的提取率见表5。

表5 不同蛋白酶的酶活力值和对河蚌肉蛋白的提取率

不同的蛋白酶具有不同的反应活力，所以合适的蛋白酶对于河蚌蛋白的提取有着重要影响。由表5可知，其中就酶活力而言，木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞风味蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶酶活力与其他4种酶相差较大；就酶解效果而言，蛋白提取率中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞风味蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白提取效果最好，但是中性蛋白酶的酶解液呈灰褐色，木瓜蛋白酶酶解液呈浅黄色，感官品质较好，综合考虑各种蛋白酶的酶活力值和酶解效果，选择木瓜蛋白酶进行酶解试验，与贺琴、郭福军等人[7，17]的试验用酶一致。

2.3 酶解提取河蚌蛋白

2.3.1 酶解pH值对蛋白提取率的影响

酶解pH值对蛋白提取率的影响见图1。

在其他条件相同的条件下，由图1可知，酶解pH值6.5时，酶解河蚌肉的蛋白提取率达到最大值；酶解pH值大于或小于6.5，蛋白提取率出现下降趋势。因此，可得出木瓜蛋白酶的最适酶解pH值6.5。

图1 酶解pH值对蛋白提取率的影响

2.3.2 酶解时间对蛋白提取率的影响

酶解时间对蛋白提取率的影响见图2。

图2 酶解时间对蛋白提取率的影响

由图2可得知，随着酶解时间延长，蛋白提取率呈上升趋势，在酶解时间为4 h处蛋白提取率出现峰值，未到4 h时酶解不充分，超过4 h后可能有蛋白质水解。因此，最佳酶解时间为4 h。

2.3.3 酶解温度对蛋白提取率的影响

酶解温度对蛋白提取率的影响见图3。

图3 酶解温度对蛋白提取率的影响

除了酶解pH值以外，酶解温度对于酶的提取效率也有着重要的影响。由图3可知，酶解温度小于50℃时，蛋白提取率逐渐增加；在酶解温度50℃处，蛋白提取率出现峰值；超过50℃后，蛋白提取率出现下降趋势，推测可能是温度导致酶失活所致。因此，选取木瓜蛋白酶最适酶解温度为50℃。

2.3.4 酶添加量对蛋白提取率的影响

酶添加量对蛋白提取率的影响见图4。

从图4可知，酶添加量小于3 000 U/g时，蛋白提取率迅速增加；在3 000 U/g处有最大值；超过3 000 U/g后呈下降趋势。因此，最佳酶添加量为3 000 U/g。

2.3.5 料液比对蛋白提取率的影响

图4 酶添加量对蛋白提取率的影响

料液比对蛋白提取率的影响见图5。

图5 料液比对蛋白提取率的影响

图6 酶添加量和酶解时间的交互作用图及等高线

由图5可知，料液比小于1∶9时，蛋白提取率随液体比例增加而增大，蛋白水溶水解更充分；在1∶9时，达到峰值；超过1∶9后，蛋白提取率呈下滑趋势但变化较小。因此，最佳料液比为1∶9。

2.3.6 响应面法优化酶解提取河蚌肉蛋白

酶解响应面优化试验因素与水平设计见表6，酶添加量和酶解时间的交互作用图及等高线见图6，酶解温度和酶添加量的交互作用图及等高线见图7，酶解温度和酶解时间的交互作用图及等高线见图8，酶解温度和酶解pH值的交互作用图及等高线见图9，酶添加量和酶解pH值的交互作用图及等高线见图10，酶解pH值和酶解时间的交互作用图及等高线见图11，酶解响应面优化试验设计及结果见表7。

表6 酶解响应面优化试验因素与水平设计

图7 酶解温度和酶添加量的交互作用图及等高线

图8 酶解温度和酶解时间的交互作用图及等高线

图9 酶解温度和酶解pH值的交互作用图及等高线

利用Design Expert 8.0.6软件对所得数据进行回归分析，得到回归方程为：

蛋白提取率回归模型的方差分析见表8。

由表8可知，回归模型显著（p＜0.01），失拟项不显著（p=0.063 9＞0.05），R2=0.840 4表明此模型能解释84.04%响应变化，回归方程拟合度较好，说明此模型能较好地拟合和预测实际情况。通过比较回归方程的系数可以比较因素影响的显著性[18]。由回归方程可知，河蚌肉的酶解过程中，对蛋白提取率的影响程度为酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度＞酶添加量。

经响应面优化试验分析得出，木瓜蛋白酶酶解河蚌肉的最优条件为酶解时间4.35 h，酶解温度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70，与徐兆刚等人[10]的优化结果相近，在此条件下预测的蛋白提取率为70.297 3%。为了检验模型预测的可靠性，取最佳酶解条件为酶解时间4.4 h，酶解温度48℃，酶添加量3 729 U/g，酶解pH值6.7，进行3次验证试验，测得的蛋白提取率为71.42%，与预测值接近，表明预测值拟合性较好。因此，经响应面法优化得到的工艺参数较可靠，具有实用性。

图10 酶添加量和酶解pH值的交互作用图及等高线

表7 酶解响应面优化试验设计及结果

2.4 超声波-微波酶解

2.4.1 超声波-微波处理对河蚌肉蛋白提取率的影响

图11 酶解p H值和酶解时间的交互作用图及等高线

表8 蛋白提取率回归模型的方差分析

超声波-微波处理对河蚌肉蛋白提取率的影响见图12。

图12 超声波-微波处理对河蚌肉蛋白提取率的影响

超声波-微波处理可以有效提高蛋白质的酶解效率[19]，在其他条件相同时，由图12可知，超声波-微波处理与未处理的样品相比较，在不同的酶解时间，蛋白提取率均有不同程度提高。经超声波-微波处理的样品在酶解2 h时，蛋白提取率已经高于未经超声波-微波处理酶解4 h的样品，可见超声波-微波处理不仅能提高蛋白提取率，还大幅缩短了所需酶解时间。

2.4.2 微波功率对河蚌肉蛋白提取率的影响

微波功率对河蚌肉蛋白提取率的影响见图13。

图13 微波功率对河蚌肉蛋白提取率的影响

微波可以有效提供能量让蛋白质酶解效率上升，蛋白质分解更彻底，但是微波的功率过高可能导致酶或者蛋白的结构遭到破坏，卞蓉霞[20]研究表明，在微波体系中木瓜蛋白酶最为稳定，所受微波影响比其他蛋白酶更小。可见找到一个合适的微波功率对于蛋白质的提取有着重要的影响。由图13可知，微波功率为300 W时，河蚌肉酶解的蛋白提取率最高；超过300 W后，随着微波功率增加，蛋白提取率出现下降趋势。可能是因为过高的微波功率使河蚌肉蛋白或木瓜蛋白酶受热受到破坏。因此，最佳微波功率为300 W。

2.4.3 超声波-微波处理时间对河蚌肉蛋白提取率的影响

超声波-微波处理时间对河蚌肉蛋白提取率的影响见图14。

图14 超声波-微波处理时间对河蚌肉蛋白提取率的影响

由图14可知，超声波-微波处理时间为4 min时蛋白提取率最高，超过4 min后随着微波处理时间加长蛋白提取率下降。可能是因为超声波-微波处理时间过长使河蚌蛋白和木瓜蛋白酶结构受到破坏。因此，最佳超声波-微波处理时间为4 min。

2.4.4 正交优化超声波-微波酶解

超声波-微波酶解正交试验因素与水平设计见表9，超声波-微波酶解正交试验结果见表10。

按照极差大小分析出对河蚌蛋白提取率影响的主次顺序为C＞A＞B，即处理时间＞酶添加量＞微波功率。正交试验确定的最佳处理条件为A3B3C2，即酶添加量4 000 U/g，微波功率400 W，微波处理时间3 min。在最佳工艺参数的条件下进行3次验证试验，所得蛋白提取率为87.25%。因此，正交优化试验结果可靠，具有可行性。经超声波-微波处理后的蛋白提取率比未经处理的高出22%，可见超声波-微波处理不仅加速了酶解，还使酶解程度更加彻底，蛋白利用率更高，这与郝立静[21]的研究结论一致。

表9 超声波-微波酶解正交试验因素与水平设计

表10 超声波-微波酶解正交试验结果

3 结论

（1）通过单因素试验和响应面优化试验得出木瓜蛋白酶酶解河蚌肉最优参数为料液比1∶9，酶解时间4.35 h，酶解温度48.22℃，酶添加量3 729.07 U/g，酶解pH值6.70。在此条件下，经验证试验，蛋白提取率达到71.42%，与预测值基本吻合。

（2）经单因素试验和L9（34）正交优化得到超声波-微波酶解河蚌肉的最优参数为微波功率400 W，微波处理时间3 min。在此条件下，蛋白提取率达到87.25%，是未经超声波-微波处理的蛋白提取率的1.22倍。为进一步制备河蚌肉蛋白粉奠定基础。