黄冬丽，何云富，何亚涛，丁功涛

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124）

0 引言

固定化酶技术近年来广泛应用于医药、食品加工等领域，由于其具有利用率高、酶活性好、节约资源等优势，因此成为研究的热点。胰蛋白酶来源于动物的胰脏，一般用于消化细胞间的软组织。当其水解蛋白质时，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，细胞间黏蛋白和糖蛋白被除去，影响细胞骨架，使细胞分离[1]，在医药、食品工业等领域有着广泛的应用[2]。由于胰蛋白酶在水溶液中会发生自身消化反应，存在利用率不高、无法回收利用、工业生产上成本高等问题，因此常采用固定化技术对胰蛋白酶进行固定化，提高了胰蛋白酶的利用率[3]。

戊二醛作为片状载体与胰蛋白酶固定化反应体系中的交联剂，具有2个反应性活性醛基，可与胰蛋白酶分子中的氨基酸残基和片状载体上暴露的活性位点发生反应，产生稳定的交联桥，从而在反应中达到胰蛋白酶固定化的目的。片状载体是由高分子材料聚丙烯合成的纸片状载体，用于动物细胞贴壁生长，半悬浮培养的载体，其内部含有网格结构，也便于在戊二醛处理后与胰蛋白酶发生交联。张黎明等人[4]采用壳聚糖固定化胰蛋白酶，提高了胰蛋白酶的利用率，但固定化载体难回收。与传统的固定化材料相比，片状载体不仅提高了酶的利用率，还具有易回收的优点[5]，在生产中可以节约成本。由于其突出的优势，因此在今后的实际生产中具有更加广泛的应用前景。试验主要对胰蛋白酶的固定化时间、固定化温度、固定化pH值和固定化胰蛋白酶质量分数进行初步探讨，并对固定化效果进行评估，希望为以后的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

胰蛋白酶、片状载体，民海生物有限公司提供；氢氧化钠、无水乙醇、体积分数为38%的盐酸溶液、体积分数为20%的戊二醛溶液、硫酸铵，烟台市双双化工有限公司提供；氢氧化钠、无水乙醇、硫酸铵，均为分析纯。

1.2 主要仪器

Biomate 5型紫外可见分光光度计，上海智成有限公司产品；ISS-4075型立式水平摇床，上海沉汇仪器有限公司产品；MT90型磁力搅拌器，温州迈腾机械科技有限公司产品；MP120-BLE型便携式酸度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 固定化活性载体的预处理

准确称取试验组片状载体5.00 g，先分别加入到磨砂口三角瓶中，再加入小号磁性转子，最后加入20 mL 70%乙醇，20 mL 0.5 mol/L的硫酸铵溶液，20 mL 4%HCl溶液，20 mL 4%NaOH溶液，加盖，置于温度15℃的磁力搅拌器中，设置转速100 r/min，时间30 min，启动搅拌器，待结束后将载体用蒸馏水水洗至中性，取出磁性转子。

1.3.2 胰蛋白酶的固定化

紫外分光光度计测定不同浓度胰蛋白酶溶液的吸光度，设置吸收波长为280 nm，吸光度为0.2～0.8，绘制标准曲线，得到方程，R2≥0.9判定为可信。

称取经预处理的片状载体，分别加入质量分数为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的胰蛋白酶溶液，0.3%的戊二醛溶液，加盖，置于水平摇床上，设置转速、时间、温度、pH值，结束后取出载体，将滤液转移到试管中，并放在4℃冰箱中静置1 h，取上清液测吸光度[6]，以吸光度计算固定化载量。

1.3.3 酶活力的测定

测定胰蛋白酶活力可以采用Folin法[7]。具体方法如下：加入2%的卵清白质作为底物，然后加入一定量的胰蛋白酶液，在温度35℃，pH值8的条件下恒温振荡10 min，终止反应后抽取滤液用Folin试剂显色，于波长680 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 交联剂浓度对固定化酶载量及活力回收率的影响

不同质量分数戊二醛对固定化酶活力回收率的影响见图1。

图1 不同质量分数戊二醛对固定化酶活力回收率的影响

由图1可知，酶活力回收率随戊二醛质量分数的增加而逐渐下降。在质量分数达到0.3%之前，酶活力回收率随戊二醛质量分数的增加下降的较慢；当质量分数达到0.3%之后，由于戊二醛质量分数过高，抑制了酶的活性，导致酶活力下降，故在戊二醛质量分数达到0.3%之后，酶活力回收率下降明显[8]。

不同质量分数的戊二醛对酶固定化载量的影响见表1。

由表1可知，酶的固定化载量随戊二醛质量分数的升高而增加。在戊二醛质量分数达到0.3%之前，酶的固定化载量随戊二醛质量分数的升高增加明显，当质量分数达到0.3%以后，酶的固定化载量基本不再增加。

结果表明，0.3%戊二醛和0.4%戊二醛作为交联剂对固定化载量影响差异不显著，对固定化酶活力回收率影响差异显著。在研究中可以确定固定化反应体系中最佳戊二醛质量分数为0.3%。

表1 不同质量分数的戊二醛对酶固定化载量的影响

2.2 胰蛋白酶质量分数对固定化率的影响

在固定化温度35℃，固定化pH值8.0，固定化时间3 h，取相同量的载体5.00 g，只改变胰蛋白酶质量分数为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，分别制备固定化胰蛋白酶。

不同质量分数胰蛋白酶对固定化率的影响见图2。

图2 不同质量分数胰蛋白酶对固定化率的影响

由图2可知，在胰蛋白酶质量分数达到2.0%时，此时酶的固定化率最高。相同质量的片状载体加入不同质量分数的胰蛋白酶，固定化率随着胰蛋白酶质量分数的升高而增加。由于片状载体可固定的胰蛋白酶的酶量是有限的，在胰蛋白酶质量分数增加到一定量之后，片状载体对胰蛋白酶的固定化量已接近饱和，固定化率达到最高；此后，再增加酶质量分数，固定化率基本不再变化[9]。结果表明，胰蛋白酶在质量分数达到2%时固定化率最高，在研究中可以确定反应体系中胰蛋白酶质量分数达到2%时固定化效果最好。

2.3 不同固定化时间对固定化率的影响

在固定化温度35℃，固定化pH值8.0，胰蛋白酶质量分数2%，取相同量的载体5.00 g，只改变固定化时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，分别制备固定化胰蛋白酶。

不同固定化时间对固定化率的影响见图3。

图3 不同固定化时间对固定化率的影响

由图3可知，在固定化时间为1.5 h时，酶的固定化率最高。片状载体内部有网格状结构，具有较大的比表面积。在反应的开始阶段，胰蛋白酶的固定化速率较快，故固定化率随着固定化时间的增加而升高较快；随着固定化时间增加到1.0～1.5 h，固定化量逐渐达到饱和，此时固定化率的增长速度放缓；在固定化达到1.5h后，片状载体对胰蛋白质量分数的固定化量已经达到饱和，此后再增加固定化时间，对酶的固定化率影响不大[10]。结果表明，固定化时间达到1.5 h时固定化率最高，在研究中可以确定反应体系中固定化时间达到1.5 h时固定化效果最好。

2.4 不同固定化温度对固定化率的影响

在固定化pH值8.0，胰蛋白酶质量分数2%，固定化时间3 h，取相同量的载体5.00 g，只改变固定化温度25，30，35，40，45，50℃，分别制备固定化胰蛋白酶。

不同固定化温度对固定化率的影响见图4。

图4 不同固定化温度对固定化率的影响

由图4可知，在固定化温度达到40℃时，固定化率最高。温度对固定化率的影响主要通过影响酶的活力来调节。当固定化温度较低时，酶的活力受到抑制，此时酶的固定化率较低；随着固定化温度的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在达到酶的最适温度时，酶的固定化率最高；此后再升高固定化温度，反而会抑制酶的活性，导致酶的固定化率下降[11]。结果表明，固定化温度达到40℃时固定化率最高，在研究中可以确定反应体系中固定化温度达到40℃时固定化效果最好。

2.5 不同固定化pH值对固定化率的影响

在固定化温度35℃，胰蛋白酶质量分数2%，固定化时间3 h，取相同量的载体5.00 g，只改变固定化pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，分别制备固定化胰蛋白酶。

固定化pH值对固定化率的影响见图5。

图5 固定化pH值对固定化率的影响

由图5可知，在固定化pH值达到8.0时，固定化率最高。固定化pH值对固定化率的影响主要通过影响酶的活力来调节。当固定化pH值较低时，酶的活力受到抑制，此时酶的固定化率较低；随着固定化pH值的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在达到酶作用的最适pH值时，酶的固定化率最高；此后pH值再增加，反而会抑制酶的活性，导致酶的固定化率下降[12]。结果表明，固定化pH值达到8时固定化率最高，在研究中可以确定反应体系中固定化pH值达到8.0时固定化效果最好。

3 结论

固定化温度，固定化pH值，固定化时间和胰蛋白酶质量分数都是影响胰蛋白酶固定化率的重要因素，通过控制这些固定化条件，同时选用合适的固定化载体，在温和的反应条件下，可成功地制备性能优良的固定化胰蛋白酶。

目前常采用的固定化材料有纤维素球、壳聚糖和磁纳米材料，然而，试验所选用的固定化材料为片状载体。与传统的固定化材料相比，片状载体具有成本低、操作简单、易回收、固定化率高等优点。

同时固定化酶也解决了游离酶稳定性低、易降解、难回收的缺点，为生产简化了操作，节约了成本，也为以后关于固定化酶的研究提供了参考。