秦紫琼，杭瑜瑜，裴志胜，齐 丹

（海南热带海洋学院生命科学与生态学院，海南三亚 572022）

0 引言

多糖是所有生命有机体的重要组成成分，并与维持生命所必需的多种功能有关，抵抗癌症、增强免疫力、抵抗病毒感染、消炎、缓解高血糖和高血脂等方面都呈现出较好的效果[1-5]，在动植物中存在广泛。

我国的菠萝产量大，菠萝罐头是主要产品，在加工制作的过程中，菠萝皮渣会作为废物丢弃，造成资源浪费的同时污染环境[6]。然而，菠萝皮渣中含有大量植物多糖，对其加以提取利用，能提高菠萝的附加值。多糖的提取方法主要有溶剂浸提 法[7]、超声波辅助提取法[8]等。采用此类方法提取时，大多以水作为溶剂，提取的多糖能力有限。在提取过程中加入合适的酶液，有助于降解细胞壁，从而使多糖能够最大可能地溶解并释放出来，提取率也会有所提高[9]。酶解法提取多糖的优点也较多，如：提取条件比较温和、产物中的杂质容易除去，提取率较高[10]。采用木瓜蛋白酶法从菠萝皮渣中提取多糖，并研究了其体外抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

菠萝皮渣预处理工艺：新鲜的菠萝皮渣→清洗→灭酶→干燥→粉碎过筛。

1.1.2 试剂

葡萄糖标准品，西亚试剂；无水乙醇、木瓜蛋白酶（酶活30×104U/g）、硫酸、苯酚、磷酸氢二钠、柠檬酸、硫酸铁、水杨酸、Tris-HCl、邻苯三酚，以上均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

DX612C型干燥箱，雅马拓科技贸易有限公司产品；CS-700型高速多功能粉粹机，永康市天祺盛世工贸有限公司产品；Heraeus Multifuge X3型离心机，赛默飞世尔科技产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菠萝皮渣多糖的提取工艺

称取5.0 g菠萝皮渣粉末置于锥形瓶中，加入适量蒸馏水，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，调节pH值，而后加入木瓜蛋白酶，在60℃条件下酶解2 h，在90℃条件下进行灭酶处理，静置30 min后，过滤、浓缩，浓缩液用Savag法脱蛋白，以转速4 500 r/min离心15 min，上清液加入4倍体积的无水乙醇在4℃下沉淀24 h，以转速4 500 r/min离心20 min，收集沉淀，分别用丙酮、无水乙醚、无水乙醇洗涤，在60℃条件下真空干燥，所得产品即为菠萝皮渣粗多糖。

1.2.2 多糖提取率的测定

1.2.3 单因素试验和响应曲面优化试验

分别选取木瓜蛋白酶添加量、料液比、酶解pH值和酶解时间这4个因素进行单因素试验，在此基础上进行响应曲面试验设计。

响应曲面试验的因素水平见表1。

表1 响应曲面试验的因素水平

1.2.4 菠萝皮渣多糖体外抗氧化活性研究

参照李南薇等人[12]的方法，在比色管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同质量浓度菠萝粗多糖溶液 （50，75，100，125，150 mg/L） 2 mL， 加入5 mmol/L H2O2溶液3 mL，摇匀后静置15 min，再加入5 mmol/L水杨酸溶液3 mL，摇匀后静置40 min，于波长510 nm处测不同质量浓度的菠萝皮渣粗多糖吸光度A1。H2O2换为去离子水时测得的吸光度为A2，样品换为去离子水时测得吸光度为A0。计算样品对羟自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量的影响

在料液比1∶15，酶解pH值6.0，酶解温度60℃的条件下酶解2 h，研究木瓜蛋白酶添加量对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

木瓜蛋白酶添加量对多糖提取率的影响见图1。

由图1可以看出，木瓜蛋白酶添加量在0.5%～1.5%时，多糖提取率增加迅速；当木瓜蛋白酶添加量大于1.5%时，多糖提取率呈下降的趋势。木瓜蛋白酶添加量过低，会使酶解反应的速率降低且酶解不完全，从而使提取率降低；随着木瓜蛋白酶添加量的增加，反应速率加快，多糖提取率也逐渐增加，但木瓜蛋白酶添加量过多时，底物浓度过高会影响分子扩散性[13]，菠萝皮渣多糖提取率有所下降。

2.1.2 料液比的影响

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，酶解pH值6.0，酶解温度60℃的条件下酶解2 h，研究料液比对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

料液比对多糖提取率的影响见图2。

图1 木瓜蛋白酶添加量对多糖提取率的影响

图2 料液比对多糖提取效率的影响

由图2可看出，增加提取液，多糖提取率会有所增高，因为提取液增加有利于提取的多糖转移到液相中，提取率会升高。当料液比为1∶20时，多糖提取率达到最大，继续增加溶液的用量，反应体系浓度过低，提取不完全，多糖提取率下降[14]。

2.1.3 pH值的影响

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，料液比1∶15，酶解温度60℃的条件下酶解2 h，研究酶解pH值对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

酶解pH值对多糖提取率的影响见图3。

图3 酶解pH值对多糖提取率的影响

由图3可看出，在酶解pH值4.0～6.0时，多糖提取率与酶解pH值呈正相关趋势。当酶解pH值大于6.0时，多糖提取率有所下降。pH值酶活性和稳定性影响较大，不适宜的酶解pH值会改变酶活性中心的构象，亦或是使整个酶分子的结构发生改变，从而导致其变性和失活，进而影响菠萝皮渣多糖提取率[15]。

2.1.4 酶解时间的影响

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，料液比1∶15，酶解pH值6.0，酶解温度60℃条件下，研究酶解时间对菠萝皮渣多糖提取率的影响。

酶解时间对多糖提取率的影响见图4。

图4 酶解时间对多糖提取率的影响

表2 响应面法试验结果

各因素交互作用对菠萝皮渣多糖提取率影响的响应曲面见图5。

图5反映了各单因素和两两交互作用对多糖提取率的影响，结合表3和图5的分析可以看出，各单因素对多糖提取率的影响程度为木瓜蛋白酶添加量＞酶解pH值＞料液比＞酶解时间，木瓜蛋白酶和料液比相互作用不显著，酶解pH值和酶解时间相互作用不显著，其余各因素的相互作用均显著。

根据回归方程模型分析可知，酶解法提取菠萝皮渣多糖的最优工艺为木瓜蛋白酶添加量1.29%，料液比1∶16（g∶mL），酶解pH值6.37，酶解时间3.24 h。

由图4可知，在酶解时间3 h以内，菠萝皮渣多糖提取率与酶解时间呈正相关趋势。当酶解时间超过3 h后，多糖的提取效率有所下降。在一定时间范围内，酶解时间越长，植物细胞壁及间层中的纤维素有所降解，一些大分子物质（如糖类），会扩散到溶液中，多糖提取率有所提高。但超出一定时间范围，酶解时间再延长，氢离子会水解一些多糖的主要成分，提取率有所下降。

2.2 响应曲面试验结果与分析

采用软件Design Expert 8.0.7中的Central Composite模式对料液比、木瓜蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解时间设计响应面试验。

响应面法试验结果见表2，响应面试验结果的方差分析见表3。

利用Design Expert 8.0.6软件，木瓜蛋白酶添加量、料液比、酶解pH值、酶解时间进行多元拟合分析，得到二次多项回归方程：

表3 响应面试验结果的方差分析

2.3 菠萝皮渣多糖的体外抗氧化活性测定结果

图5 各因素交互作用对菠萝皮渣多糖提取率影响的响应曲面

菠萝皮渣多糖对羟基自由基的清除效果见图6。

图6 菠萝皮渣多糖对羟基自由基的清除效果

由图6可看出，随着菠萝多糖质量浓度的逐渐增大，对羟自由基的清除能力越增强。对数据相关分析，得到多糖质量浓度和清除率的回归方程式为Y=0.244 7X-0.062，R2=0.996 2。

3 结论

通过单因素和响应曲面试验，优化了木瓜蛋白酶法提取皮渣中多糖的最佳提取工艺，木瓜蛋白酶添加量1.29%，料液比1∶16（g∶mL），酶解pH值6.37，酶解时间3.24 h，多糖提取率可达4.89%，所提多糖具有清除羟自由基的能力。