简永远 许展毓 冯 旭 郑宝石 覃家锦 谢晓勇

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

先天性心脏病(congenital heart disease，CHD，简称先心病)为胚胎发育异常所引起的心脏和血管形态、结构与功能的先天畸形，严重危害婴幼儿健康，其病因主要为环境因素和遗传因素[1]。心脏发育涉及各种转录因子在不同时间和空间上的调控以及多种基因的精确表达。相关基因发生改变是导致CHD的常见原因[2]。NKX 2.5基因是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子，其改变可引起基因产物转录活性的变化，影响心脏发育。据文献报道，房间隔缺损(atrial septal defect，ASD)的发病率己经超过室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)和动脉导管未闭(patent ductus arteriosus，PDA)，成为CHD最常见的类型[3]，然而大部分ASD的遗传学机制尚不明确。因此，我们拟采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及DNA测序技术，探讨广西壮族人群ASD与NKX 2.5基因突变的关系，从基因层面探索ASD患者的遗传学背景，以寻找ASD新的易感基因和突变位点。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月1日至2018年3月1日广西医科大学第一附属医院心血管病研究所收治的30例ASD患者，年龄3个月至50岁，平均18.6岁，其中男13例，女17例。所有患者均无心脏病家族史,并经超声心动图、心导管造影、心电图、胸片诊断及心脏手术确诊。排除染色体疾病者(如21-三体综合征)、综合性先天性心脏病(如charge综合征、DiGeorge综合征)者。选取同期入本院小儿外科、创伤手外科、骨关节外科患者30例，排除其他心脏相关疾病或重大疾病者。所有入选对象祖籍均为广西，其父母民族均为广西壮族，且相互无亲属关系。本研究经广西医科大学伦理委员会批准，且患者或家属均知情同意并签字。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 标本采集 患者入院时均采集空腹外周静脉血3～5 mL至真空EDTA抗凝采血管，混匀，将达标的样品置于-80℃冰箱存放，待测。

1.3 制备基因组DNA 借助抽提试剂盒(Wizard Genomic DNA Extraction Kit，Promega)，遵照相关操作步骤以及标准从外周静脉血基因中获取对应的基因组脱氧核糖核酸(genomic DNA，gDNA)。

1.4 引物设计 根据GenBank数据库中NKX2-5基因的gDNA序列，利用Primer 3.0软件在线设计6对引物,扩增片段长度350～600 bp，退火温度55℃～57℃，扩增片段为NKX 2-5基因所有外显子及外显子内含子交接处。见表1。

表1 NKX 2.5基因外显子的引物信息

1.5 NKX2.5基因目标区域的扩展 以gDNA为模板，分别使用上述4对引物通过聚合酶链式反应扩增目的基因片段。PCR反应体系：50 μL中，gDNA约0.25 g，10×反应缓冲液2.5 L，脱氧核糖核苷酸dNTP 2 μL，上、下游引物各 1 μL，DNA聚合酶(DNA polymerase)1.25 U。其中，PCR的发生条件如下：预变性环节，温度95℃，时间5 min；变性环节，温度95℃，时间30 s；退火环节，温度范围60℃～61℃，时间60 s；延伸环节，温度72℃，时间45 s；终延伸环节，温度72℃，时间7 min。35个循环后，将获得的产物用琼脂糖凝胶电泳处理，再行EB染色，最后用紫外光鉴定产物。

1.6 DNA测序 所有PCR扩增产物均采用DNA胶回收试剂盒进行纯化。测序反应产物经纯化后，以PCR下游引物为测序引物，使用ABI Prism 3130XL型自动荧光测序电泳测序。使用序列分析软件分析测序结果并将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因变异。

1.7 统计学处理 使用SPSS 20.0统计学软件分析数据，等位基因及各基因型的频率分布比较用χ2检验,行双侧检验，检验水准取α=0 .05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR结果 PCR结果经琼脂糖电泳处理之后，将其与DNA marker对比，各片段的PCR反应产物长度与所设计的各片段大小预期值符合,特异性较理想。

2.2 DNA测序结果 在CHD患者的NKX 2-5基因识别出1个不改变氨基酸的单核苷酸多态(single-nucleotide polymorphisms,SNPs) ，位于NKX 2.5基因第二外显子编码序列第606位的鸟嘌呤(G)为胞嘧啶(C)，即c. 606G>C-多态(rs3729753，Leu202Leu)，其等位基因G、C及其构成的3种基因型(GG、GC、CC)。两组基因型频率比较，差异无统计学意义(χ2=1.131，P=0.568)；两组等位基因频率比较，差异无统计学意义(χ2=1.269，P=0.260)。其中，对应的等位基因G、C 以及其组合基因GG、GC、CC等的分布情况见表2。各基因型在总体研究人群中的频率分布经χ2校验后符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.516，P=0.773)。

表2 NKX 2.5基因606位点的基因型和等位基因频率分布 [n(%)]

3 讨 论

人类NKX 2.5基因定位于染色体5q3511，作为转录因子具有2个外显子和1个内含子，该基因5′端侧翼序列与第一外显子之间包含有重要功能的基因调节结构，从而使其能够在心脏的发育、形成过程中发挥着重要的调控作用[4]。NKX 2.5基因可编码含有324个氨基酸的蛋白，对心脏的发生发育起着极为重要的作用。NKX 2.5作为转录因子调控网络的起始端，参与了心脏前体细胞的分化、心脏环化、房室分隔、房室流出道和传导系统的形成及成体心脏正常功能的维持，并持续表达于心肌细胞分化的各个阶段，在胚胎、胎儿直到成体心肌细胞中均保持一定的表达水平[5]。

迄今为止，人们已经发现40余种NKX 2.5基因突变可导致先天性心脏病。这些突变大多是外显子的无义突变、错义突变、剪接信号突变，以及寡核苷酸序列插入或缺失导致内含子剪接异常、阅读框架异位引起蛋白质截断等。与此同时，70余种与人类CHD相关的NKX 2.5基因单核苷酸多态性位点也被陆续报道[6]。研究发现CHD表型可能与突变位点及频率有关，但表型与基因型之间关系仍需确定。NKX 2.5基因突变大多是在国外研究中发现的，我国先心病人群NKX 2.5基因突变较为少见。Huang等[7]研究我国山东地区340例VSD患者，在NKX 2.5基因的上游增强子和外显子中发现了两个新的杂合子DNA序列变异，显著降低了基因转录活性。其他关于散发CHD人群的突变研究，比如张为民等[8]筛查了120例维吾尔族ASD患者，并未检测出NKX 2.5基因突变。本课题对我国壮族地区30例散发型单纯性CHD患者的研究中均未检测到致病突变，提示NKX 2.5基因突变的发生可能限于某些家系或一些带有特殊表型的个体中，其与散发型单纯性CHD的相关性可能存在地域和种族差异。

本研究通过对30名广西壮族ASD患者及30例广西壮族对照病例进行NKX 2.5基因的突变筛查，结果未发现任何突变。仅在NKX 2.5基因编码序列第606位检测到鸟嘌呤变为胞嘧啶，即c. 606G>C SNPs。本实验SNPs为不改变氨基酸的单核苷酸多态，属于同义突变。研究发现[9]，同义密码子影响着生物体内基因的转录、信使 RNA的翻译，以及合成蛋白质的结构与活性；还会改变mRNA茎环结构，影响mRNA的降解速率。

对于未能发现广西壮族地区CHD新的基因突变位点，我们认为，因本实验样本量较少，尚有待进行更广泛的筛查。另外，推测NKX 2.5基因突变可能是通过与其他基因相互作用导致CHD的发生。仅针对NKX 2.5基因测序和突变筛查，仍然不能完全解释NKX 2.5基因突变导致CHD的发病机制，下一步对于突变的转录活性、蛋白质功能等尚有待进一步研究。