蒋冬月 沈凤强 徐卢雨 李因刚 沈 鑫 柳新红

(1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江物产长乐实业有限公司，浙江 杭州 311116)

樱花是蔷薇科 (Rosaceae) 李亚科 (Prunoideae) 樱属 (Cerasus) 典型樱亚属植物的泛称。全世界约150种，分布于亚洲、欧洲、北美洲等北半球温和地带，我国有38个种，8个变种[1-2]。樱花是早春开花植物之一，花色丰富，有白色、粉色、玫红色、深红色、黄绿色及各种渐变色和交叉色，花期一般在2—5月，少数11—1月；果色多为红色、紫红色、深红色至黑色，果期为4—6月，少数10月[3]。樱花花朵数量多，独树成景，成片种植时花海极为震撼，是优良的园林彩化树种，具有极高的园林推广与应用价值。近年来，各地争相建立樱花主题公园、樱花大道、樱花长廊、樱花专类园等，对樱花品种的需求量非常大。全世界的樱花栽培品种约400余种，以日本品种居多，常见品种200余种[4-6]。目前我国园林绿化中常用的樱花只有染井吉野 (C.×yedoensis‘Somei-yoshino’)、关山 (C.serrulata‘Kanzan’)、普贤象 (C.serrulata‘Albo-rosea’) 等10余个日本品种；难以满足樱花现代化生产的需求。为迎合各地樱花市场的需求，野生樱花资源和栽培品种大量涌现，在品种数量增加的同时给樱花品种的分类鉴定工作带来了很大的困难；樱花品种同名异物或同物异名、命名不规范、亲本来源不明等现象时有发生。另外，各引种地栽培环境、营养条件和繁殖砧木各异常造成品种内一定程度的形态差异。因此，仅仅依靠形态特征的差异已不能满足樱花品种的鉴定和分类。分子标记作为一种以核酸多态性为基础的遗传标记，因其不受组织类别、发育时期、环境条件等干扰，具有数量极多、多态性高等优点，被证实是评价品种间亲缘关系和遗传多样性的理想标记[7-9]。ISSR是建立在SSR (Simple Sequence Repeat) 基础上的一种新型的分子标记技术，具有操作简单、成本低、多态性高和重复性好等优点[10]，已广泛应用于香茅属 (Cymbopogon)[11]、鸢尾属 (Iris)[12]、风信子 (Hyacinthorientalis)[13]、桃 (Prunuspersica)[14]、石榴 (Punicagranatum)[15]等植物品种间的遗传多样性和亲缘关系研究中。本研究以国内常见的樱花品种为实验材料，利用ISSR标记从分子水平研究樱花品种间的亲缘关系和遗传多样性，为樱花品种的鉴定、分类和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

在对全国樱花品种广泛调查基础上，于2015年12月，从福建省、贵州省、山东省、湖北省、上海市、云南省和浙江省7个省的樱花育种基地采集樱花品种接穗，共采集到208份樱花品种资源，共109个品种 (见表1)。将直径为1.0 cm的1 a草樱枝条截成长10 cm的插穗作为品种砧木，进行嫁接。品种嫁接苗扦插于灭菌后的苗床，采用全光照自动喷雾系统定时喷雾，每35 min喷10 s，正常管理，每10 d对砧木抹芽1次。于2016年5月采集品种的DNA样品，分别将新鲜、无病害的幼嫩叶片置于装有硅胶的自封袋中迅速干燥，然后保存于-20 ℃冰柜中备用。

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取

利用Bioteke公司生产的快速植物基因组DNA提取试剂盒 (型号DP3112) 提取208份供试材料的基因组DNA，提取前利用缓冲液对样品进行预处理，以去除大量的多糖、色素等杂质[16]。利用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，用Nanodrop超微量分光光度计测定DNA浓度，并将其稀释到50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2ISSR-PCR反应

经过预实验确定PCR优化体系为20 μL反应液，包括2 × Taq PCR Master Mix (TSINGKE公司) 10 μL，ISSR-primer 0.6 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，47.10～59.50 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中150 V电泳30 min，然后置于自动凝胶成像系统中拍照、记录。

ISSR引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，PCR Master Mix (blue) 购于TSINGKE公司。

1.3 数据处理

采用人工计数法对电泳结果进行统计，同一引物的同一位置扩增有带记为1，无带记为0，构建01矩阵[17]。根据数据矩阵，利用Ntsys 2.1软件计算各样品间的遗传相似系数和遗传距离，并采用UPGMA法进行聚类；利用Popgene 32软件计算群体的等位基因数 (Na)、有效等位基因数 (Ne)、Nei′s基因多样性指数 (H)、Shannon′s信息指数 (I) 等遗传参数[18]。

2 结果与分析

2.1 ISSR标记多态性分析

通过对DNA质量和浓度的检测，得出208份叶片基因组DNA的浓度均大于350 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230均大于2.0，说明提取获得的DNA样品纯度较高，杂质较少，能够满足ISSR检测的需求。从美国哥伦比亚大学公布的100条ISSR通用引物中共筛选出15条扩增条带清晰、稳定性高、重复性好并呈多态性的引物 (见表2)。利用筛选出的15条ISSR引物分别对208份樱花品种基因组DNA进行扩增，共获得91条清晰的条带，扩增条带在250～1 200 bp之间；其中，多态性条带83条。UBC834引物对部分樱花基因组DNA扩增图谱见图1。不同ISSR引物扩增的多态性条带数不同，为4～7条，平均每个引物扩增5.53条多态性条带，平均多态性条带比率为91.21%。这些均表明15条ISSR引物对樱花品种基因组DNA扩增的多态性较高，说明樱花在分子水平上的遗传多样性比较丰富。

表2 ISSR引物退火温度及扩增结果Table 2 The annealing temperature and amplification results of ISSR primers

注：Y=(C, T)，R=(A, G)。

2.2 不同地区樱花品种的遗传多样性

樱花品种水平上等位基因数 (Na) 为1.940 3，有效等位基因数 (Ne) 为1.521 5，多态位点百分率达94.03%。樱花在各栽培区之间的遗传多样性存在差异 (见表3)，多态位点百分率 (PPB) 在16.42%～83.58%之间，其中07ZJ > 03HB > 05SH > 02GZ > 04SD > 06YN > 01FJ，浙江地区的PPL最高，福建地区最低，各地区平均PPL为55.65%。Na的变化范围为1.164 2～1.835 8，平均为1.556 5；Ne的变化范围为1.085 9～1.491 2，平均1.343 1；Nei′s基因多样性指数 (H) 在0.054 8～0.289 5之间，平均为0.199 9；Shannon′s信息指数 (I) 在0.084 4～0.435 2之间，平均为0.298 0；各遗传参数均以浙江地区的最大，福建地区的最小。

樱花资源总的基因多样度 (Ht) 为0.310 7，各地区内基因多样度 (Hs) 为0.199 9，地区间的基因多样度 (Dst=Ht-Hs) 为0.110 8，地区间基因分化系数 (Gst=Dst/Ht) 为0.356 6，表明樱花在地区间和地区内均有一定程度的遗传分化，遗传变异主要存在地区内。各地区间的基因交流 (Nm) 为0.451 1，说明各地区间基因交流程度相对较低。

各地区之间的遗传距离在0.02～0.44之间，平均0.18，遗传一致度在0.65～0.98之间，平均为0.84。其中，福建地区与贵州地区遗传距离最大，遗传一致度最低；湖北与浙江遗传距离最小，一致度最高 (见图2)。

图1UBC834引物对部分樱花基因组DNA的扩增图谱
Fig.1 The profile amplified with primer UBC834 of some DNA

表3 各地区樱花品种的遗传多样性Table 3 Genetic diversity of Cerasus cultivars in different regions

图2基于Nei′s遗传距离的UPGMA聚类
Fig.2 UPGMA dendrogram based on Nei′s genetic distance

2.3 樱花品种的聚类分析

208份樱花品种遗传相似系数的范围为0.30～0.97，平均为0.64；其中SD06与SD12，SD11与SD22，SD12、SD19和SD29，YN07与YN08的相似系数均最大，说明这些品种间亲缘关系较近；YN11和HB97的遗传相似系数最小，说明两者亲缘关系较远。樱花品种间的遗传距离为0.04～1.43，平均0.59；其中SD06与SD12，SD11与SD22，SD12、SD19和SD29，YN07与YN08的遗传距离仅为0.04，说明两者亲缘关系最近，与遗传相似系数的结果相同；FJ03与HB100，FJ03与HB51，SH21与FJ01，SD21与HB20，SH21与SD08，SH21与YN10遗传距离均最大，说明彼此间亲缘关系相对较远。

根据遗传相似系数对樱花品种进行聚类分析，在遗传相似系数为0.62时，208份品种分为2大类 (见图3)，Ⅰ类群主要为福建、山东和云南地区的品种，Ⅱ类群主要为采自贵州、湖北、浙江和上海的品种。当遗传相似系数为0.82时，除SD21外，Ⅰ类群分为E1、E2和E3小类群。其中，E1类群主要为寒绯樱系列，花色为深红色；E2类群花色为淡红色系列；E3类群花色为白色、淡红色和红色，其中红色系列的品种聚在一起。当遗传相似系数为0.664时，Ⅱ类群又分为A、B、C 3个小类群，A类群、C类群为山樱系的园艺栽培品种；B类群主要为华中樱系列和大岛樱-寒绯樱-江户彼岸系列。

图3樱花种质资源基于遗传相似系数的UPGMA聚类
Fig.3 UPGMA dendrogram ofCerasusgermplasm resources based on genetic similarity coefficients

3 结论与讨论

分子标记技术是继形态标记、细胞标记以及(生化标记之后发展起来的直接反映遗传多样性的一种遗传标记，可以高效、稳定、准确地鉴定植物材料，评价品种间亲缘关系和遗传多样性，已在牡丹 (Paeoniasuffruticosa)[19]、月季 (Rosachinensis)[20]、杜鹃 (Rhododendron)[21]等花卉中广泛应用。在樱花种质资源的研究上，Badenes等[22]、曹东伟等[23]利用RFLP标记得出不同樱桃的亲缘关系；Gerlach等[24]、周春玲等[25]、Hormaza[26]成功利用RAPD技术对樱花进行亲缘关系鉴定和品种分类；Antonius等[27]、Kato等[28]、商韬等[29]通过SSR标记研究樱花资源的遗传多样性。本研究利用筛选出的15条ISSR引物对208份樱花进行PCR扩增，共获得83条多态性条带，引物平均多态性条带比率为91.21%，樱花品种水平上多态位点百分率达94.03%，Nei′s基因多样性指数为0.309 5。说明樱花品种间存在丰富的遗传变异，筛选获得的15条ISSR引物可以有效地反映208份供试材料间的亲缘关系。这与前人的研究结果一致，宋常美等[30]利用21条ISSR引物对64份中国樱桃资源多样性进行分析，得到引物的多态性比例为87.28%；艾呈祥等[31]对34份樱桃资源进行ISSR分析，得到多态性比率为95.97%；Shahi-Gharahlar等[32]通过ISSR对伊朗的野生樱花资源多样性研究，得出其多态性比率均大于81.80%；林立等[33]利用14条ISSR探究39个樱花品种的亲缘关系，得出其引物多态性比例为93.58%，平均Nei′s基因多样性指数为0.268 3；这些研究结果均证明ISSR可以反映樱花品种间的亲缘关系。由于ISSR标记采用17～22个碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段，其比PAPD标记的长度更长，更稳定，重复性更好，且与SSR相比其多态性更丰富，通用性更高[34-35]；因此，ISSR标记可作为樱花资源鉴定的有效手段。

不同地区樱花品种的遗传多样性结果显示各地区平均多态位点百分率为55.65%，说明品种分布具有一定的地域特征。樱花基因多样度的分析也可以看出品种在地区间和地区内均有一定程度的遗传分化，地区内的基因多样度和基因分化系数大于地区间的，说明这些遗传变异主要存在于地区内。同时，各地区间的基因交流仅为0.451 1，小于1.00，说明各地区间基因交流程度相对较低，各地区的品种由于人为选择及生长环境差异等原因，产生了一定程度的遗传分化，这与前人对广西甜茶 (Rubussuavissimus)[17]、七叶一枝花 (Parispolyphyllavar.chinensis)[36]、浙江红花油茶 (Camelliachakiangoleosa)[37]、桃 (Prunuspersica)[38]等植物多样性的研究结果一致。基于Nei′s遗传距离和遗传相似系数的UPGMA聚类分析均表明，208份品种可以分类2大类，一类为福建、山东和云南地区的品种，另一类为贵州、湖北、浙江和上海的品种。各类群中，遗传背景相近的樱花品种聚在一起，地里分布相近的品种基本上也能相邻而聚；如八重寒绯樱、福建山樱花、重瓣中国红等，其彼此间遗传相似系数较大，遗传距离较小，具有较近的亲缘关系，这些品种聚为了E1类群。研究发现Ⅱ类群中的B类群由于品种亲本来源比较复杂，大岛樱、寒绯樱、江户彼岸樱及其杂交后代虽然聚为一类，但类群内部各品种系列并未完全分开，这可能由于地区间的品种差异对实验结果造成了影响，也可能是因为所用的ISSR标记数量有限，不能满足该复杂类群内品种区分，有待后续进一步深入研究。

樱花作为早春开花乔木之一，花色丰富、花型各异，独树成景，是园林景观绿化中不可或缺的观花观果观叶树种，具有极高的应用价值。研究樱花品种的遗传多样性和亲缘关系可为今后樱花资源的保护和利用提供理论依据，为后期新品种选育提供花色艳、花量大、抗逆性强的亲本材料。本研究通过ISSR标记的方法，在分子水平揭示了所收集到的樱花品种具有丰富的遗传多样性，品种分布具有明显的地域特征。证明了ISSR分子标记是分析樱花品种遗传多样性十分有效的方法。因此，在今后的研究中可利用分子标记与形态标记相结合的方法，对全国范围内的樱花品种进行鉴定和分类。

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