黄伟 ，冉飞 ，余杨红 ，谢玉珍 ，段荣 ，柯江维

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒(Enterovirus，EV)引起的，肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CAl6)是最主要的病原体[1-4]，以发热和手、足、口腔、咽部等部位出现疱疹或者溃疡为主要特征，是一种儿童常见的全球性传染病，严重时可引发中枢神经系统(CNS)并发症，甚至导致重症患儿死亡，其中EV71病毒是重症手足口病最主要的病原体[5，6]。实时荧光定量PCR为目前临床早期诊断实验室检测的主要方法[7，8]，其特点不仅检测快速，而且具有高度灵敏度和高特异性，并且可同时检测EV71、CA16和肠道病毒通用型，对手足口病肠道病毒病原体检测实现全覆盖[9]。Fang Y等[10]通过mata分析得出，首次就医的确诊能显著降低重症手足口病的风险。由此可见，如何提高手足口病实验室病原学的诊断效率，尤其是提高肠道病毒（CoxA16、EV71等）特异性核酸检测阳性的灵敏度、准确性，对疾病的治疗、预防和控制有着及其重要的作用。而能否提取出高质量的核酸则是实时荧光定量PCR检测的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。目前很多公司纷纷推出自己的全核酸自动提取仪器，各种原理的都有，本文将对西安天隆NP968自动核酸提取仪 (磁珠法)和手工法在手足口病肠道病毒咽拭子标本前处理的比较，评价纳米磁珠核酸自动提取仪在手足口病肠道病毒RNA荧光定量PCR检测中的应用价值，为纳米磁珠核酸自动提取仪在手足口病肠道病毒核酸提取中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 96例咽拭子样本均来源为我院2016年6月份门诊手足口病疑似患儿 （根据卫生部《手足口病诊疗指南（2010 年版）》[11]诊断），发病年龄0～5岁，性别、体重、营养状况未统计。

1.2 RNA 提取方法

1.2.1 样本处理及实验分组 将生理盐水2～4ml加入无菌咽拭子管中，振荡混匀，备用。实验分为两个组：⑴核酸提取仪组：加入100μl咽拭子样本混匀液至天隆核酸提取试剂盒。⑵Trizol提取组：加入100μl咽拭子样本混匀液至Trizol和氯仿中。

1.2.2 NP968核酸提取仪提取法 天隆 NP968核酸提取仪利用磁珠吸附原理，从病毒样本中提取手足口病肠道病毒RNA。按照说明书操作，试剂配制、加样（在96孔板的第1及第7排中分别加入30μl Proteinase K、100μl样品及 4μl Acryl Carrier），运行自动化程序(预先根据说明书设定裂解/结合/洗涤/洗脱/弃磁珠的时间和反应体积及温度)，自动化程序结束后将第6及第l2排的洗脱液转移至干净EP管中。

1.2.3 Trizol提取法 将咽拭子样本混匀液 100μl加入Trizol和氯仿中，吹打静置3min，12000r/min离心2min；样品即分成水样层、中间层和有机层，收集水样层通过SiO2沉淀RNA来还原，离心取沉淀加入75%乙醇液洗涤，离心沉淀，60°C加热干燥，加入30μl DEPC水混匀，待用。

1.3 实时荧光 PCR扩增 反应体系 20μl如下：RNase Inhibitor 1μl，5xReverse Transcriptase Buffer 4μl，OL68-1 Primer 1μl，dNTP Mixture(l0mM each)1μl，MMLV Reverse Transcriptase 1μl，样品 RNA 1μl，DEPC 水 11μl。

循环条件设置如下：40℃ 25min，1个循环；94℃ 3min，1 个循环；93℃ 15s，55℃ 45s，40 个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。根据CT值判定结果：CT值≥38为阴性，CT值＜35为阳性，35≥CT值＜38为检测灰区，亦判定为阳性结果。

1.4 统计学分析 计量资料以均数±标准差 （x±s）表示，采用配对t检验或两独立样本t检验比较，计数资料的比较采用χ2检验。应用SPSS 16.0统计软件进行分析，使用GraphPad Prism 5.0进行制图，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 稀释法检测手足口病肠道病毒两种方法提取的阳性检出率 我们随机抽取96例门诊疑似手足口病标本，使用两种方法同时进行检测，实验结果显示，NP968核酸提取与手工提取法阳性检出率二者差异无统计学意义 （P>0.05），两者检出率见表1；随后用无菌生理盐水做103倍稀释，稀释后NP968核酸提取仪阳性检出率更高，有统计学意义(46.9%vs 39.6%，P=0.016)，见表 2。

表1 两种方法检查手足口病的检出率（n=96）

表2 稀释后两种方法的检测结果

2.2 比较两种提取的批内精密度及重复性 从手足口病肠道病毒阳性样本中各取一份低CT值（强阳性）和高CT值（弱阳性）标本，分别用自动核酸提取法和手工法每组连续测定10次所得结果经两独立样本T检验统计分析批内精密度，结果显示患儿手足口病肠道病毒在高CT值（弱阳性）组，NP968核酸自动提取较Trizol法提取精密度高，有统计学意义(36.70±0.17 vs 37.40±0.23，P<0.05)，而低CT值（强阳性）组，二者无明显差异（21.40±0.16 vs 21.40±0.26，P>0.05），见图 1A；随后，从手足口病肠道病毒阳性样本高CT值（弱阳性）组随机抽取10份阳性标本，平行重复做3次计算CT值的平均值，测算两种提取方法的变异系数，经配对T检验结果显示NP968核酸提取仪法重复性较手工Trizol提取法好（36.39±0.27 vs 36.68±0.38，CV 0.74%vs 1.04%），见图 1B。

图1 两种提取方法批内精密度及重复性的比较

3 讨论

本课题研究表明NP968核酸提仪在手足口病肠道病毒RNA提取阳性检出率、精密度、重复性等方面均优于Trizol手工法。值得一提的是，本次实验研究中，我们发现随着样本稀释倍数的增加导致手工提取的阴性检出率增加、阳性检出率减小，表明全自动核酸提仪灵敏度高于手工提取法，因而全自动核酸提取仪可以为临床诊断手足口病肠道病毒浓度更低的样本提供更有价值的帮助；此外，手工提取的阴性检出率增加还可能是因为手工提取法核酸提取处理时间较长，操作较为烦锁，周围环境中广泛存在的RNA酶能快速降解病毒RNA，造成标本假阴性结果。

目前，我们没有进行交叉污染率的相关性研究，虽然全自动核酸提取仪在阳性检出率、精密度、重复性方面具有优势，但由于仪器内的气溶胶、仪器程序运行错误以及仪器中磁力棒的污染是一个值得考虑的问题，这是一个导致对阴性标本交叉污染的潜在问题。相比全自动核酸提取仪提取手足口病肠道病毒RNA病毒，传统手工提取一个潜在的担忧是手工提取效果主要依赖检验技术人员的技术娴熟度。另外，本文对纳米磁珠法和Trizol法提取手足口病肠道病毒进行对比，纳米磁珠法与手工提取法阳性检出率分别为55.2%和54.2%，其手工提取法阳性检出率和江西省内其他医院基本相同[12]。本课题研究未进行EV71与CA16病毒分组提取阳性诊断率的比较，我们认为全自动核酸提取仪与手工法提取在不同类型的手足口病肠道病毒提取中其灵敏度和特异性有可能存在差异，因此有必要对EV71和CA16两种病毒提取进行方法学上的进一步研究。此外，其他实际问题如标本处理速度、人力成本已有文献报道[13]，故本实验室不再进行研究分析。

总之，纳米磁珠核酸自动提取仪在手足口病肠道病毒核酸提取中的应用有利于应对手足口病流行季节或爆发流行时大批量标本的处理，降低劳动强度，实现手足口病标本的高效、快速、准确地处理。同时，提高实验室生物安全防护水平，保障医务工作者的职业卫生与安全，保障医疗质量和医疗安全有着极其重要的作用和意义。