胡栋宝+黄太聚+李潇雨

摘要：以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法，于420 nm波长处测定吸光度，计算紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）根莖中总黄酮的含量。结果表明，在4～28 μg/mL的范围内，芦丁含量与吸光度有良好的线性关系，加标回收率为100.25%（n=4，RSD=0.92%），紫五加根茎提取液中总黄酮平均含量29.62 μg/mL。该方法简便、快速、准确、灵敏，可作为紫五加根茎中总黄酮含量的测定方法。

关键词：紫五加（Acanthopanacis senticosi Radix）；紫外分光光度法；总黄酮；含量

中图分类号：O657.32；O949.763.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）22-4341-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.22.033

Abstract： Rutin was used as control， the absorbance was determined at the wavelength of 420 nm by UV spectrophotometry， and the content of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix was calculated. The results showed that at 4～28 μg/mL，there was a good linear relationship between rutin content and absorbance，the recovery rate was 100.25%（n=4，RSD=0.92%），the average content of total flavonoids in stems of Acanthopanacis senticosi Radix is 29.62 μg/mL. This method is simple，rapid，accurate and can be used as a method for the determination of total flavonoids in roots of Acanthopanacis senticosi Radix.

Key words： Acanthopanacis senticosi Radix； UV spectrophotometry； total flavonoids； content

紫五加（Acanthopanax senticosi Radix），隶属五加科，生长于灌木丛中，现已实现人工栽培，茎杆为浅紫色，果实呈球状，有特异香气[1]。紫五加在云南省墨江县成为了特有的特色生态蔬菜。紫五加具有生津止渴、提高睡眠质量、消除精神疲劳等功效，被誉为“睡眠专家”和“血管清道夫”。

黄酮类化合物是具有酮式结构的一类化合物，主要有抗氧化、抗肿瘤、抗微生物和除味等功能，对植物体的生长发育起着重要的作用。黄酮类化合物大多不溶于水，易溶于有机溶剂，其分子中大多含有酚羟基而使该化合物呈酸性，因此易溶于稀碱性水溶液、吡啶及二甲基甲酰胺等有机溶剂[2]。黄酮类化合物可发生氢氧化钠反应、铝盐反应、浓硫酸反应、浓氨水反应、铁离子反应、盐酸-锌粉反应，因此，可将该类反应用于鉴定黄酮类化合物[3]。目前国内提取黄酮的方法主要有索氏提取法、超声波浸提法、微波提取法、加热回流法、溶剂萃取等方法。

本研究以墨江县紫五加为研究对象，采用紫外分光光度法测定紫五加根茎中总黄酮含量，将为该种生物资源的开发利用提供理论方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 所用样品采自云南省普洱市墨江县，经墨江县农经站农艺师许忠鉴定为紫五加，样品保存于玉溪师范学院资源环境学院植化室。

1.1.2 仪器和试剂

1）仪器。索氏提取器、可调控温电热套、电子分析天平、UV-2550型紫外分光光度计。

2）试剂。116 μg/mL芦丁试剂，精密称取芦丁对照品5.8 mg（已于105 ℃恒重），用40%乙醇溶解，并定容至50 mL[4]；0.1 moL/L三氯化铝溶液，取结晶三氯化铝2.46 g于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，备用；1.0 moL/L醋酸钠溶液，取无水醋酸钠8.20 g于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，备用。

1.2 方法

1.2.1 紫五加根茎中总黄酮的提取 准确称取经预处理后的紫五加根茎粉末1 g，用滤纸包裹后放入索氏提取器中，加入100 mL 40%的乙醇溶液回流提取，直到颜色变得较浅为止，用相应浓度的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中（反复洗涤圆底烧瓶及滤纸包）备用。

1.2.2 最大波长的选取 准确移取116 μg/mL的芦丁标准溶液1.00 mL于25 mL比色管中，分别加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL、1 mol/L醋酸钠溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容至刻度线，摇匀放置40 min，在200～800 nm处测定吸光度，以试剂空白做参比，将最大吸收峰作为最佳测定波长，以该波长作为试验的测定波长。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制 精确吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL比色管中，按表1加试剂，用40%乙醇溶液定容、混匀，静置40 min，于420 mm处测定吸光度，用试剂空白做参比在最大波长420 nm处测定其吸光度，绘制芦丁标准曲线。并以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线[5]。

1.2.4 单因素试验

1）提取浓度的选择。准确称取1.000 g经预处理后的紫五加茎粉末，用滤纸包好后放入索氏提取器的提取筒中，用浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液100 mL回流提取2 h，将提取液移至100 mL的容量瓶中定容，移取同一的样品液15.00 mL于25 mL的3支比色管中，加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸钠溶液5 mL， 用不同浓度的乙醇定容、摇匀，放置40 min。以试剂空白作参比，在420 nm处测定其吸光度。

2）提取时间的选择。称取1 g经预处理后的紫五加茎粉末，在索氏提取器中放入已经用滤纸包裹好的紫五加茎粉末，加入40%乙醇溶液100 mL分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 6组样品，转移至10 mL的容量瓶并定容，准确移取1 mL样品溶液于3支25 mL比色管中，分别加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL；加入1.0 mol/L醋酸鈉溶液5 mL，定容并混匀，放置40 min。测定吸光度并用试剂空白作参比。

2 结果与分析

2.1 最大波长的选取

由图1所示，在400～460 nm范围内，吸光度先随波长的增加而增加，到420 nm后开始下降，而在420 nm处的吸收峰为最大值，因此选用420 nm为最大吸收波长[6]。

2.2 芦丁标准曲线的绘制

由图2可知，该标准曲线的回归线方程为y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，（y为吸光度，x为芦丁浓度）。芦丁浓度在4～28 μg/mL范围内具有较好的线性关系。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 提取浓度的选择 由图3可以看出，在其他条件保持不变的情况下，紫五加根茎中的总黄酮含量随着乙醇浓度的升高而升高，而当乙醇浓度为40%时总黄酮含量达到最大值，随后总黄酮的含量逐渐降低，可能是随着乙醇浓度的增大，有些醇溶性杂质也会随之增加，从而影响了总黄酮的析出，因此，乙醇浓度选择40%较好。

2.3.2 提取时间的选择 由图4可以看出，在其他条件保持不变的情况下，紫五加根茎中总黄酮含量随着时间的增大而增大，2 h时总黄酮含量达到最大值，随后总黄酮含量逐渐降低，时间越长越不利于总黄酮提取，因此，提取时间选择为2 h较好。

2.4 样品中总黄酮含量的测定

准确称取1.000 g经预处理后的紫五加根茎粉末，用滤纸包好后放入索氏提取器中，用浓度为 40%乙醇溶液提取2 h，将提取液定容至100 mL，分别移取15.00 mL于4支25 mL比色管中，加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL、1 mol/L醋酸钠溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，摇匀放置40 min。以试剂空白作参比，在420 nm处测定其吸光度，计算样品中的总黄酮含量[7]，结果见表2。

2.5 精密度试验

准确移取已提取好的样品溶液10 mL于25 mL比色管中，并加入0.1 mol/L三氯化铝溶液3 mL、 1 mol/L醋酸钠溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容，摇匀放置40 min。以试剂空白作参比，在420 nm处测定其吸光度，连续测5次[8]，测得吸光度并计算含量，结果见表3。

2.6 回收率试验

精密称取已知总黄酮含量的紫五加根茎粉末约1 g，置于磨口锥形瓶中分别加入1 mg/mL的芦丁标准溶液5 mL，按前面样品处理法提取，计算总黄酮含量和回收率，平均回收率为100.25%，RSD=0.92%，结果见表4。

3 小结

紫五加根茎中总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度为40%、提取时间2 h，并通过以芦丁为基准物，用氯化铝-醋酸钠为显色剂在紫外分光光度计下测量绘制出标准曲线，根据回归线方程y=0.022 4x-0.003 4，R2=0.999 7，计算出紫五加根茎提取液中总黄酮的平均含量为29.62 μg/mL。

参考文献：

[1] 徐 礼.中草药有效成分分析法（下册）[M].北京：人民卫生出版社，1984.

[2] 曹根生.脉安冲剂总黄酮的含量测定方法的初步研究[J].中成药研究，1981，6（12）：13-15.

[3] 王小宁，杨黎彬，刘少静.正交实验优化山楂总黄酮提取工艺[J]. 应用化工，2012，41（11）：1963-1965.

[4] 程昆木，王 斌，曾伟芹，等.刺五加总黄酮含量的分析[J].人参研究，2006，18（2）：17-19.

[5] 孙玉艳，崔玉海，张 颖，等.紫外分光光度法测定刺五加口服液中总黄酮含量[J].中国新技术新产品，2010（14）：17.

[6] 于 洁，丰贵鹏，程 迪，等.刺五加注射液中总黄酮含量测定[J].平原大学学报，2007，24（6）：117-118.

[7] 刘伟玲.刺五加叶中的主要活性成分分析[J].中医药导报，2009， 15（7）：87-88.

[8] 王 颖，孙 捷，邢桂菊，等.刺五加片质量标准探讨[J].时珍国医国药，2001，12（2）：119-120.

[9] 徐 晓，刘起华，范 慧，等.刺五加口服液中总黄酮含量测定[J].中国林副特产，2002（1）：41.