张志信，张仕秀

（1.文山学院 生化系，云南 文山 663000；2.文山州生物资源开发研究中心，云南 文山 663000）

瓶尔小草科植物瓶尔小草Ophioglossum vulgatum L，又称一支箭、一支枪、独叶一支箭、单枪一支箭、一矛一盾、矛盾草、蛇须草。以全草入药，清热解毒，消肿止痛。用于小儿肺炎，脘腹胀痛，毒蛇咬伤，疔疮肿毒；外用治急性结膜炎，角膜云翳，眼睑缘炎。分布于东北、陕西、湖北、云南、贵州、广西、台湾及长江下游等地［1-2］。

黄酮类化合物广泛存在于植物中，生理活性作用广泛：维持血管正常的渗透压、防止血管脆化，对多种炎症、冠心病、心绞痛等均有良好的疗效。同时，黄酮类化合物还是一种良好的活性自由基清除剂，具有调整免疫和内分泌的作用，还有抗癌、抗炎等多种医疗保健作用，是一类重要的生物活性因子。瓶尔小草的叶中主要含3-O-甲基槲皮素-7-0-双葡萄糖苷-4'-O-葡萄糖苷［3］。张帼威等［4］从狭叶瓶尔小草中分离提取得到亚油酸、三油酸甘油酯、β-谷甾醇、正十五酸甘油酯、亚油酸甘油单酯、3-甲氧基槲皮素和3，4-二羟基苯甲酸。瓶尔小草功效与黄酮类化合物有着密切关系。

傅里叶变换红外光谱法（FTIR）是一种常用的分析技术，已被广泛应用在各个研究领域。其快速、整体、直观分析的新方法也适用于中药结构研究，尤其是中草药真伪、优劣、不同产地的快速鉴别、复方整体成分配伍规律变化的研究［5］，而将其应用于中药原料药提取质量监控的研究鲜见。实验以瓶尔小草为原料，采用醇提水沉—聚酰胺吸附、乙醇溶液梯度洗脱，得到不同洗脱物；采用FTIR技术分析了瓶尔小草不同乙醇溶液洗脱物的FTIR图谱特征，为瓶尔小草的提取及其提取物的深度开发研究提供技术支持。

1 实验部分

1.1 实验仪器及样材

傅立叶变换红外光谱仪（IRPresting-21型，日本岛津公司生产）；液压片机、粉碎机（XA-1型）；电子天平（Precisa XT220A 瑞士生产）；恒温干燥箱（202型），瓶尔小草，购于文山中草药市场，经文山学院沐建华高级实验师鉴定为瓶尔小草科植物瓶尔小草。

1.2 样品置备

瓶尔小草洗净烘干后粉碎，称取100 g，加8倍量的75%乙醇回流提取1.5 h，重复提取3次，合并3次提取液抽滤，滤液浓缩至浸膏状，加1/3倍量聚酰胺粉拌成糊状烘干，将其放置于聚酰胺柱顶端，用蒸馏水洗至颜色极淡，再分别用30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液作为洗脱剂，以1 mL/min流速依次洗脱，分别收集各梯度洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得到相应的洗脱物［6］，用于红外光谱分析。

1.3 光谱测试

利用傅立叶变换红外光谱仪（IRPresting-21型）分别测量30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脱物。

2 结果与讨论

2.1 瓶尔小草不同提取物的IR图谱分析

90%乙醇溶液洗脱物红外光谱图见图1及表1，在3008 cm-1为=C—H的伸缩振动吸收峰，2927 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2856 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在3200～3400 cm-1有弱吸收的宽吸收带，伸缩振动，故推测其含有—OH。1712 cm-1为羰基C=O伸缩振动吸收峰。在1600 cm-1、1516 cm-1、1415 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰；在1300～937 cm-1为C—O键伸缩振动吸收峰；721 cm-1为长链烷烃骨架振动吸收峰，以上光谱特征说明90%乙醇溶液洗脱物中含有较多黄酮类、酯类和芳香类化合物。

80%乙醇溶液洗脱物红外光谱图见图1及表1，2926 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2854 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在1705 cm-1处有强吸收峰，表明有羰基C=O伸缩振动吸收峰，并在1573 cm-1、1456 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰，以上特征说明80%乙醇溶液洗脱物中含有黄酮类化合物。

图1 90%、80%乙醇溶液洗脱物红外光谱图

表1 不同浓度乙醇溶液洗脱物的红外光谱特征峰

70%及60%乙醇溶液洗脱物的红外光谱图见图2及表1，70%乙醇溶液洗脱物红外光谱图在3311 cm-1为羟基O—H伸缩振动吸收峰，2924 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2852 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在1579 cm-1、1452 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰，以上特征说明70%乙醇溶液洗脱物中含有芳香类化合物。60%乙醇溶液洗脱物红外光谱图在2924 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2852 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在1579 cm-1、1442 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰。60%及70%乙醇溶液洗脱物的红外光谱图中峰位及峰形非常相似，可以判断60%及70%乙醇溶液洗脱物所含成分相近。

图2 70%、60%乙醇溶液洗脱物红外光谱图

50%及30%乙醇溶液洗脱物的红外光谱图见图3及表1，50%乙醇溶液洗脱物红外光谱图在3356 cm-1为羟基O—H伸缩振动吸收峰，2924 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2852 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在1602 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰；1654 cm-1为羰基（C=O）的伸缩振动吸收峰；在1072 cm-1、1042 cm-1处有强吸收峰，说明50%乙醇洗脱物中糖（苷）类成分较多，主要为黄酮苷类化合物。30%乙醇溶液洗脱物红外光谱图与50%乙醇容易洗脱物大体相同。

图3 瓶尔小草50%和30%乙醇洗脱液的红外光谱图

由图4可以看出，瓶尔小草药材在2922 cm-1有吸收峰，为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2856 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。在3200～3400 cm-1有弱吸收的宽吸收带，伸缩振动，故推测其含有—OH。1200～950 cm-1为各类C—O键振动吸收的重叠峰。1031 cm-1、667 cm-1等一系列吸收峰来自草酸钙，说明瓶尔小草中含有相当量的草酸钙。

图4 瓶尔小草及其正丁醇萃取物红外光谱图

瓶尔小草正丁醇萃取物红外光谱图显示，3446 cm-1、3421 cm-1、3406 cm-1为O—H伸缩振动吸收峰；在2924 cm-1有吸收峰，为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，2852 cm-1为亚甲基C—H反对称伸缩振动吸收峰，故推测其含有—CH2。1707 cm-1为羰基C=O伸缩振动吸收峰。在1618 cm-1、1465 cm-1为芳香环骨架振动吸收峰；在1072 cm-1、1042 cm-1处有强吸收峰，说明正丁醇萃取物中糖（苷）类成分较多，主要为黄酮苷类化合物。

2.2 瓶尔小草成分分离方法筛选

从图1至图3可以看出，采用聚酰胺吸附、乙醇溶液梯度洗脱得到的洗脱物，在1072 cm-1、1042 cm-1附近的吸收峰强度随着乙醇浓度的升高而降低，表明60%至90%的乙醇溶液洗脱物以苷元为主，而50%和30%乙醇溶液洗脱物以苷类化合物为主；80%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸收峰为2926 cm-1、2854 cm-1、2358 cm-1、1705 cm-1、1573 cm-1、1456 cm-1；70%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸收峰 为 3311 cm-1、2924 cm-1、2852 cm-1、1579 cm-1、1452 cm-1；60%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸收峰 为 2924 cm-1、2852 cm-1、2358 cm-1、1579 cm-1、1442 cm-1、1058 cm-1。80%、70%、60%乙醇溶液洗脱物三者的红外光谱的相似度高，故在洗脱时采用80%的乙醇溶液作为洗脱剂。50%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸收峰为2924 cm-1、1604 cm-1、1070 cm-1、1016 cm-1；30%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸 收 峰 为 3356 cm-1、2924 cm-1、1654 cm-1、1602 cm-1、1072 cm-1、1041 cm-1。从50%和30%乙醇溶液洗脱物的红外光谱可以看出，二者的吸收峰非常相似，故在洗脱时采用50%乙醇溶液作为洗脱剂。

把30%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液洗脱物的红外光谱吸收峰与芦丁及槲皮素的红外光谱吸收峰（见图4、图5及表2）相比较，发现6种乙醇溶液洗脱物在1712 cm-1、1705 cm-1、1699 cm-1、1654 cm-1、1604 cm-1、1602 cm-1（C=O 伸 缩振动）、1579 cm-1、1573 cm-1（芳香环骨架振动）、1456 cm-1、1452 cm-1、1442 cm-1、1415 cm-1（C—H弯曲振动）、1284 cm-1、1242 cm-1（C—O伸缩振动）等吸收峰较强，表明6种乙醇溶液洗脱物中均含有黄酮类化合物，结合30%及50%乙醇溶液洗脱物在1072 cm-1、1042 cm-1附近的吸收峰较强，故30%及50%乙醇溶液洗脱物所含的黄酮类化合物以黄酮苷为主，60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脱物，结合它们在1072 cm-1、1042 cm-1附近的吸收峰较弱，故60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脱物所含的黄酮类化合物以游离黄酮为主。

图5 槲皮素、芦丁标准品红外光谱图

表2 芦丁、槲皮素标品的红外光谱特征峰

以上结果是由于聚酰胺吸附黄酮类化合物的强度决定于形成氢键的大小，黄酮类化合物从聚酰胺柱洗脱时，苷元相同时，洗脱的先后顺序是先黄酮苷后黄酮苷元［7］，故用低于50%乙醇溶液洗脱时，得到的洗脱物以黄酮苷为主，当使用的乙醇浓度高于50%时，洗脱物以游离黄酮（苷元）为主。

3 结论

30%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液洗脱物均含黄酮类化合物，30%和50%乙醇溶液洗脱物以黄酮苷为主，60%、70%、80%和90%乙醇溶液洗脱物以游离黄酮（苷元）为主。30%和50%乙醇溶液洗脱物红外光谱相似，采用50%乙醇溶液作为洗脱剂进行洗脱；60%和70%乙醇溶液洗脱物红外光谱相似，采用70%乙醇溶液作为洗脱剂进行洗脱；80%和90%乙醇溶液洗脱物红外光谱相似度不高，需要分别采用80%和90%乙醇溶液作为洗脱剂梯度洗脱。

［1］朱成兰.云南常用中草药彩色图谱［M］.海口：海南出版社，2003：203.

［2］范亚文，包文美，王全喜.中国瓶尔小草科植物孢子形态的研究［J］.西北植物学报，1997（6）：182.

［3］赵保发，张志信，张仕秀，等.不同采收季节瓶尔小草黄酮类化合物含量分析［J］.时珍国医国药，2009（2）：345-346.

［4］张帼威，吴奶珠，范强，等.狭叶瓶尔小草化学成分的研究［J］.天然产物研究与开发，2010（6）：1006-1008.

［5］徐茂玲，李惠芬，周群，等.不同配伍方式凉血活血复方的红外光谱法研究［J］.光谱学与光谱分析，2010（3）：640-643.

［6］张志信，张仕秀.瓶尔小草黄酮类化合物的分离及紫外光谱鉴定［J］.文山学院学报，2010（4）：141-143.

［7］宋晓凯.天然药物化学第2版［M］.北京：化学工业出版社，2010：89-90.