赵瑞朋 黎 飚 黄海玲 解继胜 李 海 赵琼芝

(百色学院体育学院，广西 百色 533000)

·运动医学·

运动锻炼及雌激素受体-β基因多态性与老年女性骨质疏松的相关性

赵瑞朋 黎 飚1黄海玲1解继胜1李 海1赵琼芝1

(百色学院体育学院，广西 百色 533000)

目的研究运动锻炼及雌激素受体(ER)-β基因多态性与女性老年性骨质疏松(ADOP)的相关性。方法420例长期运动锻炼老年女性和415例非长期运动锻炼老年女性，定量超声骨质密度仪检测两组右侧足跟骨宽带超声衰减值，PCR-RFLP检测两组ER-β基因多态性。结果长期运动锻炼组ADOP的患病率明显低于非长期运动锻炼组(P<0.01)。ER-β基因Rsa Ⅰ等位基因分布频率在两组中存在显著差异(P<0.01)，r等位基因患ADOP的风险是R等位基因的1.565倍(OR=1.565，95%CI：1.270～1.928)。长期运动锻炼组携带Alu Ⅰ酶切位点的a等位基因分布频率明显少于非长期运动锻炼组(P<0.01)。结论长期运动锻炼对ADOP有防治作用。ER-βRsa Ⅰ酶切位点的r等位基因可能是ADOP的遗传易感基因。Alu Ⅰ酶切位点的a等位基因是对运动锻炼的敏感基因。

运动锻炼；雌激素受体-β；多态性；老年性骨质疏松

老年性骨质疏松(ADOP)可出现身体多部位疼痛，骨骼变形，甚至出现骨折，严重影响老年妇女的生活质量和身体健康。ADOP是与年龄、遗传、种族及运动锻炼(生活习性)相关的多基因疾病，有报道雌激素受体(ER)-β基因多态性与骨质疏松(OP)具有相关性〔1〕，但ER-β基因多态性与运动锻炼因素在ADOP 中的关联性未见报道。本课题从基因和运动锻炼的角度，探讨ER-β基因多态性和运动锻炼对女性ADOP的影响。

1 对象和方法

1.1研究对象 广西百色地区不进行体力工作的城区老年女性，长期运动锻炼组60～75岁老年女性420例，60～65岁259例，66～70岁134例，71～75岁27例，至少3年以上规律运动锻炼，运动方式为广场健身操和广场交谊舞，每周至少3次，每次锻炼40 min以上，运动后脉搏120次/min以上。非长期运动锻炼组60～75岁老年女性415例，60～65岁256例，66～70岁133例，71～75岁26例。无运动锻炼的习惯。两组各年龄段数分布基本相同(P>0.05)。两组均排除心、肝、肺、肾和内分泌等器官疾病，也无卵巢摘除，未服用对骨组织影响的激素等药物，平素无浓茶、烟、咖啡等影响骨代谢的生活习性。

1.2骨密度(BMD)的检测 用法国制造的定量超声骨质密度仪测量右侧足跟骨宽带超声衰减值(BUA)。每次测量前进行开机测量校对，由指定经过专门培训的人员操作测定。

1.3BMD临床意义的判定标准 BMD测量前进行常规体格检查时测量身高和体重。按照国际OP协会和我国临床OP的诊断标准，与本地区正常人群参考的骨峰值比较，BUA减少值<1.0为正常，1.0≤BUA减少值≤2.0为骨量减少(LBM)，2.03.0为重症OP。本实验将BUA减少值≤2.0设为正常组，BUA减少值>2.0设为ADOP组。

1.4ER基因多态性检测 ①引物设计与合成：参照有关文献设计一对引物〔2～5〕，扩增ER-β基因Rsa I位点上游引物：5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′，下游引物5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′。用于特异性扩增ER-β基因AluⅠ多态性位点的一段DNA引物序列为P1：5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′，P2：5′-AATGAGGGACCACAGCA-3′，PCR产物片段长度为307 bp。②模板DNA提取：取抗凝全血100 μl加无菌双蒸水100 μl混匀，加6 mol/L NaI 200 μl涡旋震荡30 s，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)涡旋震荡30 s，离心后取上清液加0.6倍体积异丙醇混匀，室温(或4℃)静置15 min，离心后沉淀以70%乙醇洗1次，晾干后溶于TE中，所提DNA经紫外分光光度计定量后，置-20℃保存备用。③PCR扩增及酶切：反应体系为50 μl，其中含10倍扩增缓冲液，dNTPs各200 μmol/L，引物P1、P2各0.4 μmol/L，模板DNA 0.1 μg。置热循环仪(Bio-Rad型，Japan)中95℃预变性5 min，再加入TaqDNA聚合酶2.5 U。按下列程序循环35次：94℃变性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，72℃末次延伸10 min。④扩增产物的限制性酶切：分别取PCR扩增产物10 μl，用10 U Rsa Ⅰ、8 U Alu Ⅰ于37℃酶切3 h。反应终止后产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙啶(EB)染色，染色后以DNA片段长度标准物为参考，紫外灯下观察结果并拍照。

1.5统计学处理 应用SPSS18.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1BMD测量结果 非长期运动锻炼组ADOP发病率为37.8%(157/415)，明显高于长期运动锻炼组26.9%(113/420，χ2=11.930,P<0.01)，非长期运动锻炼组患ADOP的风险是长期运动锻炼组的1.653倍(OR=1.653，95%CI：1.233～2.216)。

2.2ER-β基因型分析 使用Rsa Ⅰ酶切可使ER基因多态性区分出3种基因型：RR型(终产物为125 bp，31 bp大小的两条带)，Rr型(终产物为156 bp，125 bp，31 bp大小的3条带)，rr型(终产物为156 bp大小的1条带)；使用Alu Ⅰ酶切可区分出AA型(240 bp，67 bp)，Aa型(307 bp，240 bp，67 bp)，aa型(307 bp)。以上大写字母均表示存在点突变而出现该酶切位点；小写字母表示野生型，不存在该酶切位点。

2.3ER-β基因多态性在正常组与ADOP组的比较 ER-β的RsaⅠ等位基因频率分布在正常组与ADOP组差异显著(P<0.01)，r等位基因患ADOP的风险是R等位基因的1.565倍(OR=1.565，95%CI：1.270～1.928)。ER-β的AluⅠ等位基因频率分布在正常组与ADOP组间无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.4ER-β基因多态性在四组之间的比较 Rsa Ⅰ位点：长期运动锻炼组与非长期运动锻炼组正常亚组，ADOP亚组间R、r 等位基因频率分布无显著差异(P>0.05)。AluⅠ位点：长期运动锻炼组与非长期运动锻炼组正常亚组间a、A等位基因频率分布无显著差异(P>0.05)。长期运动锻炼组ADOP亚组携带a等位基因频率分布明显少于非长期运动锻炼组(P<0.01)，见表2。

表1 正常组与ADOP组ER-β基因RsaⅠ、Alu Ⅰ多态性分布频率〔n(%)〕

与正常组比较：1)P<0.01，χ2=17.817，OR=1.565，95%CI：1.270～1.928

表2 四组ER-β基因Rsa Ⅰ、Alu Ⅰ位点多态性分布频率比较〔n(%)〕

与长期运动锻炼组ADOP亚组比较：1)P<0.01，χ2=7.557，OR=1.774，95%CI：1.176～2.677

3 讨 论

ADOP是一种与雌激素缺乏相关的骨代谢疾病，老年妇女卵巢功能的退化，雌激素分泌的减少，引起骨代谢异常，溶骨大于成骨，导致骨量逐渐减少，引起低骨量，骨量降低到一定程度就导致OP，因此，ADOP在女性中发病率远高男性。雌激素通过ER介导对机体发生作用，ER具有遗传基因多态性，其可影响对雌激素的介导作用，对妇女ADOP的发生、发展有重要的决定性作用〔6，7〕。由此近几年来认为，ER 是与OP相关的最重要基因之一〔8〕。研究证实，运动能够降低中老年妇女骨量的丢失，能显著改善老年人的骨密度〔9～11〕。运动锻炼对ADOP防治一般都有效果，但效果对不同个体差异较大，并且即使规律的长期运动锻炼后仍有不可避免ADOP发生、发展的患者，这可能与基因多态性有关。

本实验结果提示r等位基因可能是ADOP的遗传易感基因，a等位基因是对运动锻炼敏感的基因。运动锻炼对携带ER-βAluⅠ酶切位点的a等位基因的妇女，有更为明显的ADOP防治作用。如能经过进一步的流行病学、实验室和临床研究证实，在药物治疗ADOP时，可考虑个体差异(基因型)，在药量和运动锻炼上设计更个性化的治疗方案，这将为老年妇女健康保健提供一种从基因角度结合运动锻炼(即生活习性)来防治ADOP的新思路。

1章 秋，余敦敏，邵宜波，等.安徽地区绝经后妇女的ER 基因多态性与骨密度的相关性研究〔J〕.中国骨质疏松杂志，2006；12(4)：362，365-8.

2黄海玲，韦叶生，解继胜，等.雌激素受体-β基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究〔J〕.中华妇产科杂志，2005；40(9)：644-5.

3邵 华，李 艳，夏 虹，等.正常汉族人群雌激素受体β基因多态性的研究〔J〕.中国优生与遗传杂志，2004；12(5)：21-3.

4邵 华，李 艳，张平安，等.雌激素受体β基因多态性与血脂水平的研究〔J〕.微循环学杂志，2006；16(1)：47-9.

5黄海玲，赵琼芝，解继胜，等.ER-β基因多态性与子宫内膜癌组织ER表达的相关性〔J〕.中国妇幼保健，2013；28(17)：2772-4.

6Obemayer PB，Chararas C，Kotschan S，etal.Genetic background of osteoporosis〔J〕.Acta Med Austriaca，2000；27(1)：18-20.

7Schuit SC，de Jong FH，Stolk L，etal.Estrogen receptor alphu gene polymorphisms are associated with estradiol levels in postmenopausal women〔J〕.Eur J Endocrinol，2005；153(2)：327-34.

8Tural S，Kara N，Alayli G，etal.Association between osteoporosis and polymorphisms of the bone Gla protein，estrogen receptor 1，collagen 1-A1 and calcitonin receptor genes in Turkish postmenopausal women〔J〕.Gene,2013；515(1)：167-72.

9Martyn-St James M，Carroll S.A meta-analysis of impact exercise on postmenopausal bone loss：the case for mixed loading exercise programmes〔J〕.Br J Sports Med，2009；43(12)：898-908.

10Kukuljan S，Nowson CA，Sanders KM，etal.Independent and combined effects of calcium-vitamin d3 and exercise on bone structure and strength in older men：an 18-month factorial design randomized controlled trial〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2011；96(4)：955-63.

11Kelley GA，Kelley KS.Dropouts and compliance in exercise interventions targeting bone mineral density in adults：a meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.J Osteoporos，2013;2013：250423.

〔2016-07-27修回〕

(编辑 曹梦园)

R580

A

1005-9202(2017)18-4609-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.084

国家自然科学基金项目(81560362)；广西自然科学基金(2014GXNSFAA18178，2010GXNSFA013268，2013 GXNSFAA019241)；2013年校地校企共建科技创新平台立项建设项目-桂西地区少数民族基因多态性研究平台(2013年)；广西中医药科技专项课题(CZPT13-47)；广西教育厅科研项目经费资助(200103YB115)；广西教育厅立项课题(201106LX432，2013LX105)

1 右江民族医学院基础学院

黄海玲(1972-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事雌激素依赖性疾病研究。

赵瑞朋(1984-)，男，硕士，讲师，主要从事体育教学训练和运动康复保健研究。