李豫江 张 伟 陈志刚 黄桂林

(石河子大学医学院第一附属医院普外二科，新疆 石河子 832000)

H2S对外源性LY294002预处理人结肠癌细胞凋亡的影响

李豫江 张 伟 陈志刚 黄桂林

(石河子大学医学院第一附属医院普外二科，新疆 石河子 832000)

目的研究H2S对体外培养人结肠癌细胞凋亡的影响及其机制。方法体外培养人结肠癌细胞，随机分为正常对照组、NaHS(100 μmol/L)组、LY294002(2 μg/ml)组、NaHS(100 μmol/L)+LY294002(2 μg/ml)组，采用流式细胞术检测各组干预48 h后对人结肠癌细胞凋亡的影响，Western印迹检测各组干预48 h后对人结肠癌细胞中磷酸化Akt、非磷酸化GSK-3β蛋白表达的影响。结果与正常对照组比较，NaHS组人结肠癌细胞凋亡显著降低，p-Akt蛋白表达显著增加，而GSK-3β蛋白表达显著降低(均P<0.01)。LY294002组人结肠癌细胞凋亡显著增加，p-Akt蛋白表达显著降低，而GSK-3β蛋白表达均显著增加(均P<0.01)。而与NaHS组比较，NaHS+LY294002组人结肠癌细胞凋亡显著增加，p-Akt蛋白表达显著降低，而GSK-3β蛋白表达显著增加(均P<0.01)。结论PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能介导参与了H2S对人结肠癌细胞凋亡的抑制作用。

结肠癌细胞；硫化氢；细胞凋亡；PI3K/Akt/GSK-3β信号通路

目前结肠癌的治疗方案主要还是采用手术结合放化疗的综合治疗方案，但是其生存期没有很大改善，中位生存期不足20 个月〔1，2〕。因此，研究结肠癌发生的机制，从根本上遏制其进展，对临床上治疗结肠癌，延长结肠癌的生存期具有重要意义。研究显示内源性或外源性 H2S 在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，能调节肿瘤细胞的凋亡〔3〕。然而，H2S 是否影响结肠癌细胞的凋亡，是否参与了结肠癌的发生、发展值得关注。因此，本研究应用硫氢化钠(NaHS)作为H2S供体处理人结肠癌细胞，探讨外源性H2S 对人结肠癌细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料、试剂及仪器 人结肠癌细胞Caco-2(中科院上海细胞库)保持了正常人结肠癌细胞基本形态和生物学特性。 高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(均为美国Gibco公司产品)，DMSO、LY294002冻干粉、NaHS(均为美国Sigma公司产品)，Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒(美国Invitrogen公司)，兔抗人p-Akt单克隆抗体兔、抗人GSK-3β单克隆抗体(均为Cell Signaling公司)，山羊抗兔二抗(北京中杉金桥)。细胞培养箱(美国Thermo公司)，流式细胞仪(Partec公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)，电泳槽(美国Bio-Rad公司)，凝胶电泳成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2细胞培养 人结肠癌细胞复苏后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养，当细胞生长至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养，细胞传代周期稳定后即可用于实验。

1.3实验分组 收集人结肠癌细胞，计数后接种于培养板中，待细胞完全贴壁后，弃完全培养基，加入无血清DMEM培养液同步化24 h，按实验要求分为正常对照组、NaHS(100 μmol/L)组、LY294002(2 μg/ml)组、NaHS+LY294002组，每组均干预培养48 h。

1.4流式细胞术检测各组人结肠癌细胞凋亡情况 收集对数期生长的人结肠癌细胞以2×105个/ml接种于6 孔培养板中，每孔2 ml，按照分组给予不同的处理因素，干预48 h后，收集各组人结肠癌细胞，严格按照Annexin V-PI双染法细胞凋亡试剂盒操作步骤，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.5Western印迹检测各组p-Akt、GSK-3β蛋白表达情况 收集对数期生长的人结肠癌细胞以1×106个/ml接种于6 孔培养板中，每孔2 ml，按照分组干预培养48 h 后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置20 min，12 000 r/min 离心25 min，取上清，统一蛋白浓度为20 g/L，蛋白变性后待用。蛋白经10%SDS-PAGE 凝胶分离后，采用半干转法转膜，然后经5%BSA封闭后，分别加兔抗人p-Akt一抗(1∶1 000)，兔抗人GSK-3β(1∶1 500)一抗,4℃冰箱孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗(1∶30 000)，室温摇床上孵育3 h，TBST洗膜后加入化学发光试剂曝光，显影、定影后将胶片置于凝胶成像分析进行定量分析。用同样方法检测β-actin内参蛋白的表达。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组人结肠癌细胞凋亡情况 与正常对照组〔(3.22±0.57)%〕比较，NaHS组细胞凋亡率显著降低〔(0.67±0.27)%，P<0.01〕，LY294002组〔(10.03±0.89)%〕、NaHS+LY294002组〔(6.74±0.96)%〕细胞凋亡率均显著增加(P<0.01)。与NaHS组比较，LY294002组、NaHS+LY294002组细胞凋亡率显著增加(P<0.01)，与LY294002组相比，NaHS+LY294002组细胞凋亡率显著减少(P<0.01)。

2.2各组人结肠癌细胞中p-Akt、GSK-3β蛋白表达情况 见表1，图1。与正常对照组比较，NaHS组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著增加，GSK-3β蛋白表达显著减少，LY294002组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著降低，GSK-3β蛋白表达显著增加(均P<0.01)，NaHS+LY294002组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著降低，GSK-3β蛋白表达显著增加(均P<0.01)；与NaHS组比较，LY294002组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著降低，GSK-3β蛋白表达显著增加(均P<0.01)，NaHS+LY294002组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著降低，GSK-3β蛋白表达显著增加(均P<0.01)；与LY294002组比较，NaHS+LY294002组人结肠癌细胞中p-Akt蛋白表达显著增加，GSK-3β蛋白表达显著降低(P<0.01)。

表1 各组人结肠癌细胞中p-Akt、GSK-3β蛋白表达情况

与正常对照组比较:1)P<0.01；与NaHS组比较:2)P<0.01；与LY294002组比较:3)P<0.01

1～4：正常对照组、NaHS组、LY294002组、NaHS+LY294002组图1 各组p-Akt、GSK-3β蛋白表达

3 讨 论

近些年研究发现，气体信号分子NO和CO在结肠癌的发生、发展中发挥着重要的作用，其与结肠癌的增殖、凋亡和迁移密切相关，参与了结肠癌的增殖、凋亡和迁移〔4,5〕。然而H2S作为第3种气体信号分子，广泛分布于心血管、内脏和神经系统〔6〕。研究发现：H2S能够促进结肠癌细胞的增殖〔7〕，但其是否参与结肠癌的发生与发展、对结肠癌细胞凋亡的影响如何尚未见报道。本文结果显示NaHS可显著抑制人结肠癌细胞的凋亡。研究发现，磷脂酰肌醇-3(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信号通路是细胞存活、增殖及凋亡过程中较为关键的通路，该通路被持续激活可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡反之，该通路被持续阻断，可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡〔8〕。该通路活化的机制是由PI3K通过与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体相互作用，然后通过Ras和p110直接结合导致其活化，活化的PI3K促使PDK1磷酸化的Ser308导致Akt活化，活化的Akt可使磷酸化GSK-3β蛋白表达增加，而非磷酸化GSK-3β蛋白表相对减少，从而激活Bax、Bcl-2家族成员，调节细胞线粒体内多种凋亡相关蛋白的释放，最终抑制细胞的凋亡。LY294002作为PI3K特异性阻滞剂，可特异性阻断PI3K/Akt信号通路，从而抑制下游蛋白表达而诱导细胞凋亡〔9〕。本实验说明NaHS对人结肠癌细胞凋亡的调控可能是通过激活PI3K/Akt信号通路而实现的，当运用PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后，NaHS能明显促进人结肠癌细胞的凋亡，这进一步支持NaHS对人结肠癌细胞凋亡的调控可能是通过PI3K/Akt信号通路而实现的。

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2009;59(4):225-49.

2Roper J,Richardson MP,Wanq WV,etal.The dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 induces tumor regression in a genetically engineered mouse model of PIK3CA wild-type colorectal cancer〔J〕.PLoS One，2011;6(9):e25132.

3Wu YC，Wang XJ，Yu L，etal.Hydrogen sulfide lowers proliferation and induces protective autophagy in colon epithelial cells〔J〕.PLoS One，2012;7(5):e37572.

4Bocca C,Bozzo F,Bassignana A,etal.Antiproliferative effect of a novel nitro-oxy derivative of celecoxib in human colon cancer cells:role of COX-2 and nitric oxide〔J〕.Anticancer Res,2010;30(7):2659-66.

5Babykutty S,Suboj P,Srinivas P,etal.Insidious role of nitric oxide in migration/invasion of colon cancer cells by upregulating MMP-2/9 via activation of cGMP-PKG-ERK signaling pathways〔J〕.Clin Exp Metastasis,2012;29(5):471-92.

6于 芳，赵 晶，唐朝枢，等.自行合成硫化氢缓释供体 GYY4137 对细胞活力的影响及其释放的硫化氢在小鼠体内的分布〔J〕.北京大学学报(医学版)，2010;42(5):493-7.

7洪 敏，唐小卿，何 葵，等.硫化氢对人结肠癌细胞增殖和迁移的影响〔J〕.南方医科大学学报，2014;34(5):699-703.

8Mori H,Inoki K,Masutani K,etal.The mTOR pathway is highly activated in diabetic nephropathy and rapamycin has a strong therapeutic potential〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2009;384(4):471-5.

9Park SJ，Sohn HY，Yoon J，etal.Down-regulation of FoxO-dependent c-FLIP expression mediates TRAIL-induced apoptosis in activated hepatic stellate cells〔J〕.Cell Signal，2009;21(10):1495-503.

〔2016-05-18修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R656.9

A

1005-9202(2017)18-4502-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.031

黄桂林(1961-)，男，医学博士，主任医师，硕士生导师，主要从事结直肠肿瘤发生机制研究。

李豫江(1970-)，男，医学硕士，副主任医师，主要从事结直肠肿瘤发生机制研究。