刘 飞 古远云 李 程 赵 娅 徐 勇 万 沁

(泸州医学院附属医院内分泌科，四川 泸州 646000)

肥大细胞膜稳定剂对大鼠糖尿病心肌病变的影响

刘 飞 古远云 李 程 赵 娅 徐 勇 万 沁

(泸州医学院附属医院内分泌科，四川 泸州 646000)

目的研究肥大细胞膜稳定剂酮替芬对大鼠糖尿病心肌病(DCM)的影响及可能机制。方法将45只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、DCM组和肥大细胞膜稳定剂组(Ket组)。NC组给予普通饮食，DCM组予以高脂高糖饮食加一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DCM大鼠模型，Ket组为DCM大鼠模型建模成功后给予0.025%的酮替芬溶液1 mg/kg腹膜腔内注射，2次/d，连续注射8 w。同时，NC组和DCM组给予等体积的生理盐水空白对照注射。实验完成后处死全部大鼠，剪下左心室，称取左心室重量计算全心指数和左心室重量指数，在电镜下对各组心肌组织进行观察分析，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、活性氧簇(ROS)表达，甲苯胺蓝改良染色法比较肥大细胞数量分布。结果DCM组全心指数显著高于NC组和Ket组(均P<0.05)；DCM组左心室重量指数显著高于NC组和Ket组(均P<0.05)。电镜下NC组大鼠心肌细胞核椭圆形清晰可见，闰盘连续，肌丝致密，胞内可见大量形态结构正常的线粒体；DCM组大鼠心肌细胞核固缩，线粒体肿胀，显示不清晰，闰盘扭曲断裂，肌丝溶解；Ket组大鼠心肌细胞核无明显肿胀，核膜尚光滑、完整，无核固缩表现，线粒体完整清晰。DCM组大鼠血清TNF-α、ROS显著高于NC组和Ket组(均P<0.05)。DCM组大鼠心肌组织中肥大细胞分布密度显著高于NC组和Ket组。结论糖尿病大鼠心肌组织存在肥大细胞的表达增强，肥大细胞膜稳定剂酮替芬可减轻DCM。肥大细胞表达的增强可促进TNF-α和ROS的表达，部分参与DCM的发生发展。

糖尿病心肌病；肥大细胞；酮替芬

糖尿病心肌病(DCM)是2型糖尿病(T2DM)患者重要的致死原因之一〔1〕。目前DCM的发病机制尚未完全清楚。研究表明DCM的发病与氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗等因素有关〔2〕。肥大细胞作为一种多功能的炎症细胞，近年来在糖尿病及其并发症的发生发展中的作用受到广泛关注。本研究旨在探讨肥大细胞在大鼠DCM发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1动物模型制备及分组 8周龄雄性Wistar大鼠50只(重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司)，体重180～200 g，适应性喂养2 w后，随机选取其中35只大鼠用于T2DM大鼠造模，留15只大鼠作为正常对照组(NC组)。NC组继续给予普通饮食喂养，T2DM造模组给予高脂高糖饮食，喂养6 w后，用链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg(用前以pH4.2的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配成1%的浓度)一次性腹腔注射，NC组仅注射相同剂量的枸橼酸缓冲液作为对照。72 h后造模组大鼠尾静脉取血测空腹血糖(FPG)，≥16.7 mmol/L视为T2DM大鼠造模成功，其中31只造模成功。将31只造模成功的大鼠随机选取30只，随机将其分为DCM组15只和肥大细胞膜稳定剂干预组(Ket组)15只，DCM和Ket两组继续给予高脂高糖饮食喂养，同时NC组给予普通饮食喂养，4 w后测量三组大鼠体重，Ket组每只大鼠给予0.025%的酮替芬溶液1 mg/kg腹膜腔内注射，2次/d，NC组和DCM组给予等体积的生理盐水空白对照注射。

1.2方法

1.2.1取材及病理学观察 继续喂养大鼠8 w后处死，分离取下心脏，称量全心重量，然后剪下左心室，称取左心室重量计算全心指数(全心重/体重，HW/BW)和左心室重量指数(左心室重量/体重，LVW/BW)，最后用4%甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度2 μm。按常规取材制作左心室透射电镜的超微结构标本，用电镜观察心肌组织病变。

1.2.2肥大细胞染色及计数 采用甲苯胺蓝改良染色法。将左心室心肌组织于4%甲醛液固定24 h后，系列乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。4 μm连续石蜡切片，脱蜡至水，置甲苯胺蓝液(质量浓度为0.5 g/L)40 min，水洗1～2 min后以0.5%冰醋酸分化，至胞核和颗粒清晰(镜控)，水洗2 min，冷风吹干，中性树胶封固。随机连续计数5个视野(×200)内肥大细胞数，取其平均值。

1.2.3肿瘤坏死因子(TNF)-α和活性氧簇(ROS)的检测 从大鼠心脏取血，3 000 r/min离心10 min，将血清和血细胞迅速小心地分离，再严格按照大鼠TNF-α和ROS酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒说明书步骤进行，检测ROS和TNF-α在450 nm处各孔的吸光度(OD 值)。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，t检验。

2 结 果

2.1各组全心指数和左心室重量指数比较 DCM组全心指数、左心室重量指数显著高于NC组和Ket组(P<0.05)，见表1。

2.2各组大鼠血清TNF-α和ROS比较 DCM组血清TNF-α、ROS水平明显高于NC组和Ket组(P<0.05)，见表1。

2.3各组大鼠心肌细胞超微结构比较 电镜下可见NC组心肌细胞核椭圆形清晰可见，闰盘连续，肌丝致密，胞内可见大量形态结构正常的线粒体；DCM组心肌细胞核固缩，线粒体肿胀，显示不清晰，闰盘扭曲断裂，肌丝溶解；Ket组心肌细胞核无明显肿胀，核膜尚光滑、完整，无核固缩表现，线粒体完整清晰。见图1。

2.4各组大鼠心肌组织肥大细胞分布比较 DCM组肥大细胞数量〔(3.9±0.34)个/mm2〕显著高于NC组〔(1.8±0.27)个/mm2〕及Ket组〔(2.5±0.53)/个mm2,P<0.05〕。

表1 各组体重、全心指数和左心室重量指数及大鼠血清TNF-α和ROS比较

与DCM组比较：1)P<0.05

图1 各组左心室心肌组织电镜图(×10 000)

3 讨 论

T2DM可引起心脏微血管病变、心肌代谢紊乱和心肌纤维化等所致的心肌广泛结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态。炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗等被认为是DCM发病的重要因素。

肥大细胞作为一种重要的炎症细胞，研究发现它可通过释放各种介质促进TNF-α的释放，而TNF-α为一种重要的炎症介质，可以通过还原型辅酶Ⅱ氧化酶增加心肌细胞ROS的产生〔3～5〕。ROS作为反映氧化应激状态的标志〔6〕，可通过以下5种途径造成心肌肥厚、纤维化、左心室功能损伤，促进DCM的进展。①通过激活PKC途径，导致心脏中晚期糖基化终末产物生成增加〔7〕。②激活内质网应激〔8〕。③直接氧化蛋白质和脂质引起细胞蛋白或磷脂损坏。④参与DNA损伤，尤其是对线粒体DNA的损害。通过使DNA链断裂，激活多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，PARP过度激活导致细胞内NAD耗竭，细胞氧化还原进一步失衡。⑤产生过氧亚硝基盐阴离子，细胞内的亚硝基化，进一步损伤线粒体呼吸链功能。

本研究显示，DCM发病与肥大细胞活化相关，肥大细胞膜稳定剂酮替芬可通过抑制肥大细胞的活化减低TNF-α等炎症因子的释放，TNF-α的降低也一定程度上减少ROS的生成，从而减弱心肌组织炎症反应和氧化应激反应，进而对DCM起到一定的干预治疗作用。

1Xu Y，Wang L，He J，etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults〔J〕.JAMA，2013；310(9)：948-59.

2Goyal BR，Mehta AA.Diabetic cardiomyopathy pathophysiological mechanisms and cardiac dysfunction〔J〕.Hum Exp Toxicol，2013；32(6)：571-90.

3Westermann D，Van Linthout S，Dhayat S，etal.Tumor necrosis factor-alpha antagonism protects from myocardial inflammation and fibrosis in experimental diabetic cardiomyopathy〔J〕.Basic Res Cardiol，2007；102(6)：500-7.

4Ti Y，Xie G，Wang Z，etal.TRB3 gene silencing alleviates diabetic cardiomyopathy in a type 2 diabetic rat model〔J〕.Diabetes，2011；60(11)：2963-74.

5Swindle EJ，Metcalfe DD，Coleman JW.Rodent and human mast cells produce functionally significant intracellular reactive oxygen species but not nitric oxide〔J〕.J Biol Chem，2004；279(47)：48751-9.

6Stolen TO，Hoydal MA，Kemi OJ，etal.Interval training normalizes cardiomyocyte function，diastolic Ca2+control and SR Ca2+release synchronicity in a mouse model of diabetic cardiomyopathy〔J〕.Circ Res，2009；105(6)：527-36.

7Willemsen S，Hartog JWL，Hummel YM，etal.Tissue advanced glycation end products are associated with diastolic function and aerobic exercise capacity in diabetic heart failure patients〔J〕.Eur J Heart Fail，2011；13(1)：76-82.

8Li J，Zhu H，Shen E，etal.Deficiency of rac1 blocks NADPH oxidase activation，inhibits endoplasmic reticulum stress and reduces myocardial remodeling in a mouse model of type 1 diabetes〔J〕.Diabetes，2010；59(8)：2033-42.

〔2016-05-07修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R589

A

1005-9202(2017)18-4496-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.028

万 沁(1971-)，女，教授，硕士，主要从事糖尿病大血管并发症研究。

刘 飞(1987-)，男，医师，硕士，主要从事糖尿病大血管并发症研究。