李晓燕 高艳凤 曹宏敏 陈慧娜

(安阳市人民医院肾病科，河南 安阳 830011)

白细胞介素-17家族细胞因子参与调控糖尿病大鼠肾脏炎症反应的相关性

李晓燕 高艳凤 曹宏敏 陈慧娜

(安阳市人民医院肾病科，河南 安阳 830011)

目的研究糖尿病(DM)大鼠肾脏组织中白细胞介素(IL)-17家族各成员的表达情况并探讨其在炎症反应中的作用。方法采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射(150 mg/kg)法建立DM大鼠模型，代谢笼收集大鼠24 h尿液，ELISA法测定大鼠24 h尿蛋白，全自动生化分析仪测定血液肌酐、尿素氮水平；应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法及Western印迹测定IL-17A、IL-17F mRNA、蛋白表达情况。结果与对照组大鼠相比，DM大鼠模型制作成功4 w时肾功能显著下降，8 w肾功能下降更加显著；肾脏IL-17A及IL-17F在4 w时转录及翻译水平均显著升高，8 w时升高更加显著；DM大鼠肾脏IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E表达水平与对照组无明显差异。结论在肾脏炎症反应过程中起主要作用的是IL-17A及IL-17F，有可能成为改善DM肾病的有效靶点。

糖尿病肾病；炎症反应；白细胞介素17A；白细胞介素17F

糖尿病(DM)是目前导致肾衰竭的首要原因，新增的透析患者中45%以上为糖尿病肾病(DN)所致〔1〕。越来越多的研究显示炎症反应在DN的发生发展过程中扮演重要角色〔2〕。白细胞介素(IL)-17是一种主要由T细胞分泌的炎症因子，在器官移植、自身免疫疾病、肿瘤等的发生发展中发挥重要作用〔3～6〕。IL-17家族包含6种结构同源的配体：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和 IL-17F，目前关于IL-17家族各分子在DN中的作用还有待进一步研究。本实验观察DM大鼠肾脏组织中IL-17A～F的表达情况并探讨其在炎症反应中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、试剂与仪器

1.1.1动物 清洁级SD大鼠60只，雄性，体重160～210 g，平均(183±10.8)g，购自维通利华实验动物技术公司，小鼠饲养和实验严格遵照中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。适应性饲养1 w后，随机选择20只为DN组。采用一次性腹腔注射枸橼酸缓冲液配置的链脲佐菌素(STZ)溶液(150 mg/kg)建模〔7〕。对照组给予等量枸橼酸缓冲液。注射后1 w测量大鼠空腹血糖(FPG)，FPG>11.2 mmol/L即为建模成功。

1.1.2主要试剂和仪器 STZ购自Sigma公司，抗GAPDH、抗IL-17A～F抗体均购自英国Abcam公司，引物合成由Invitrogen公司完成，荧光定量基因扩增仪为美国Bio-Rad公司CFX96型，紫外可见分光光度计为美国Thermo Scientific公司ND 2000C型，凝胶成像分析系统为美国Bio-Rad公司Universal Hood Ⅱ型，生化分析仪为迈瑞BS-380型。

1.2标本采集 建模成功后分别在第4、8周末，CO2法处死大鼠15只，切开腹部取出肾脏，然后立即放入液氮中，继而矢状纵行剖开，分别置于-80℃冰箱冻存待做后续检测。

1.3生化检测 第4周、8周末分别将15只对照组和DN组大鼠置于代谢笼中收集24 h尿液，离心后取6 ml上清液，用ELISA法检测24 h尿微量蛋白。大鼠处死后腹腔静脉取血4～5 ml，全自动生化分析仪检测肌酐及尿素氮。

1.4应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(RF-PCR)检测IL-17家族各分子mRNA表达情况 取出冻存的肾脏组织，使用Trizol Reagent提取组织总RNA，紫外分光光度计检测提取的RNA浓度。引物序列IL-17A上游：TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA；下游：CTTTCCCTCCGCATTGACAC；IL-17B下游：CATACTCTTCCATTCGAGCGTAG，上游：CTCCTGCTTCTAGGCTGGTTG；IL-17C上游：CTCCTGCTTCTAGGCTGGTTG，下游：CCACCTGGCACTTCGAGTTAG；IL-17D上游：AGCACACCCGTCTTCTCTC，下游：GCTGGAGTTCGCACTGTCC；IL-17E上游：ACAGGGACTTGAATCGGGTC，下游：TGGTAAAGTGGGACGGAGTTG；IL-17F上游：TGCTACTGTTGATGTTGGGAC，下游：AATGCCCTGGTTTTGGTTGAA；GAPDH上游：GTGTAACCCATAACCCCCAAGA，下游：CACCAGCAGACCCTCAAGC。

逆转录方法参照M-MLV试剂盒操作程序进行。扩增反应体系10 μl，反应条件：94℃ 2 min预变性，94℃ 10 s变性，60℃ 20 s退火，72℃15 s延伸，共进行40个循环，最后一个循环后72℃ 10 min总延伸。选择Houskeep gene GAPDH作为内标，对目的基因进行均一化。目的基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法，将对照组标本内目的基因表达水平设为1，对DN组标本内目的基因表达水平进行标准化。

1.5蛋白质印迹法 -80℃保存的肾组织每组各取约100 mg加入适量PBS，电子匀浆仪匀浆，10 000 r/min离心15 min，去上清后加入适量蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂混合物。4℃静置30 min，每10 min漩涡振荡器振荡1次；10 000 r/min离心15 min取上清液，测定蛋白浓度并调整样品浓度一致。电泳：上样量30 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，电泳2 h。湿式转膜法将蛋白转至PVDF膜上，电压80 V，时间1 h。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，室温振摇1 h。4℃下一抗(1∶3 000)孵育过夜；TBST洗膜，15 min×4次;室温下二抗(1∶5 000) 孵育1 h，TBST洗膜，15 min×4次。混合等体积显色液A 液和B 液，将显色剂滴加到PVDF 膜正面，于凝胶成像分析仪上进行检测。以GAPDH为内参照，通过Image J软件计算目标蛋白与GAPDH的灰度比值进行半定量分析。

1.6统计学分析 应用SPSS18.0软件，两组数据的比较采用Studentt检验或Mann-Whitney检验(均为双尾)。

2 结 果

2.1大鼠DM模型制作 STZ注射后5 d，大鼠死亡2例，其余DN组大鼠经FPG验证，均符合DM模型标准。

2.2各组大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮水平对比 DN组4 w时尿蛋白、肌酐、尿素氮水平显著高于对照组，8 w时升高更加明显(P<0.05)。见表1。

2.3大鼠肾脏IL-17家族各因子在转录水平的表达 与对照组相比(1.7±0.8，2.2±1.3)，DN大鼠IL-17A表达在第4、8周末均显著升高(5.1±1.6，10.5±1.8，P<0.01或P<0.001);IL-17F表达在第4、8周末均显著升高(4 w对照组1.1±0.3，DN组3.5±0.5；8 w：对照组1.0±0.3，DN组4.0±0.7，P<0.01)；与对照组(4 w:1.3±0.5,1.2±0.2,0.9±0.3,0.8±0.3;8 w：1.3±0.8,1.2±0.4,1.2±0.2,1.1±0.3)比较，DN大鼠肾脏IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E表达水平无明显差异(4 w：1.6±0.5，1.5±0.4，1.1±0.2，1.3±0.3；8 w：1.7±0.8，1.6±1.4，1.4±0.2，1.5±0.4)。

2.4大鼠肾脏IL-17A及IL-17F在翻译水平的表达 与对照组比较，DN组大鼠IL-17A、IL-17F蛋白在第4、8周表达均显著升高；IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E蛋白表达无明显差异。见图1。

表1 各组大鼠尿蛋白、尿素氮、肌酐水平对比

与对照组比较：1)P<0.05;2)P<0.01

图1 各组大鼠肾脏IL-17A及IL-17F蛋白的表达

3 讨 论

DN是DM的一种致命性并发症，其病理特点是肾小管及肾小球基底膜增厚、胞外基质积聚、连续性系膜增生〔1〕。流行病学调查显示，约1/3的DM患者承受着DN的影响〔8〕。虽然进行严格的胰岛素治疗、限制蛋白质摄入量、控制血压等措施可以延缓DN的发生，但是却不能从根本上逆转这种疾病〔9〕。以往研究证实多种炎症分子及细胞因子导致的炎症反应是DN主要发病机制〔10〕。最新研究显示，对小鼠给予严格的生酮饮食(5%碳水化合物，8%蛋白质，87%脂肪)可以逆转轻微的DN〔11〕。虽然对于人类来说这种极端的饮食方式基本是不可能的，但是这项研究揭示了DN是可以通过靶向调控目标分子实现逆转的。IL-17家族细胞因子由于其强大的促炎调控作用而受到关注〔12〕。它们可以诱导多种细胞因子表达，如IL-6、IL-1、TGF-β、TNF-β、TNF-α以及趋化因子IL-8、MCP-1等。通过这些细胞因子及趋化因子，IL-17在类风湿关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、移植排斥反应以及牛皮癣和多发性硬化症中发挥作用。IL-17家族各成员都具有独特的表达部位和方式。IL-17A和IL-17F由激活的T细胞分泌，并在炎症反应期间表达上调；IL-17B主要在表达在一些外周组织和免疫器官；IL-17C在炎症反应期间表达也会上调，但在一般情况下呈低表达状态；IL-17D在神经系统和骨骼肌中高表达，IL-17F在多种外周组织中都呈低表达状态〔12〕。本研究显示，DM大鼠肾功能明显受到损害；DM大鼠建模成功后4 w时IL-17A及IL-17F在翻译水平表达均增高，8 w末升高更加显著。说明IL-17A和IL-17F在DN的进展过程中很可能发挥重要作用。Tong等〔13〕研究发现与野生型DM模型小鼠相比，IL-17A基因敲除DM模型小鼠的蛋白尿症状和肾间质损害要轻，提示抑制IL-17的表达将改善DN的症状，甚至对其进行逆转。而目前关于抑制IL-17A或IL-17F对于DN的作用还无相关报道。另外有研究显示IL-17在肾脏可能通过TRAF6、NF-κb通路介导炎症反应〔14，15〕。进一步的研究可通过抑制IL-17A、IL-17F表达或抑制TRAF6、NF-κB通路，观察对DM模型大鼠肾脏的影响及变化。

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〔2016-11-19修回〕

(编辑 徐 杰)

R587

A

1005-9202(2017)18-4489-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.025

李晓燕(1973-)，女，副主任医师，主要从事肾病和血液净化研究。