益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549细胞增殖的影响

2017-09-27牟海军毕红霞石寒冰孙玺媛赵学梅蒋丽艳王绍清

中国老年学杂志 2017年18期

关键词：抑制率药理学腺癌

赵丹牟海军毕红霞石寒冰孙玺媛赵学梅蒋丽艳宋波王绍清

(齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸二科，黑龙江齐齐哈尔 161000)

益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549细胞增殖的影响

赵丹1牟海军毕红霞石寒冰孙玺媛2赵学梅1蒋丽艳1宋波1王绍清1

(齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸二科，黑龙江齐齐哈尔 161000)

目的探讨益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法(1)应用血清药理学方法制备益肺解毒方药物血清。60只SD大鼠，分为低、中、高剂量组及空白血清组，每组15只。给予低、中、高剂量益肺解毒方煎剂及等体积生理盐水灌胃3 d，然后腹主动脉取血，制备益肺解毒方药物血清。(2)应用噻唑蓝(MTT)法检测益肺解毒方含药血清、顺铂及将两者协同后对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用。益肺解毒方药物血清组分为3个剂量组(低、中、高剂量组)、空白血清组、顺铂组；联合组(低、中、高剂量益肺解毒方与空白血清联合顺铂)。将顺铂设为5个浓度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另设空白对照组、空白调零组。每组设6个复孔，实验重复3次。计算各组对人肺腺癌A549细胞增殖抑制率。结果低、中、高剂量益肺解毒方药物血清对人肺腺癌A549细胞增殖均具有抑制作用(P<0.05)，且剂量与抑制率呈一定量效关系。顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖亦具有抑制作用，且随着浓度的增高，抑制率逐渐增高，作用呈现浓度依赖效应。中、高剂量益肺解毒方药物血清与顺铂协同，协同指数>1.15，数据结果提示益肺解毒方可以协同顺铂增加其疗效。而应用低剂量益肺解毒方则与顺铂协同效应为单纯相加。结论益肺解毒方联合顺铂对肺腺癌A549细胞具有协同增效作用。

益肺解毒方；顺铂；肺腺癌A549细胞；细胞增殖；细胞凋亡

肺癌发病率、死亡率均位于恶性肿瘤第一〔1〕，临床主张采用综合治疗。本课题组自主研制益肺解毒方，其主要作用为补气养阴以助正气；解毒消癥以祛邪气。前期临床研究发现此方可改善老年肺癌患者呼吸道临床症状和体力状况，提高生活质量；与化疗结合，临床疗效明显增强，且不良反应发生率较低，患者的依从性、耐受性较高〔2〕。但其作用机制尚不明确。本课题观察益肺解毒方药物血清联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠(北京维通利华有限公司)；人肺腺癌A549细胞(齐医学院岳丽玲研究员赠)。益肺解毒方主要组成包括生白术、生黄芪、北沙参、石见穿、天冬、茯苓、石上柏、山药、金雀根、重楼等药物；胎牛血清(Hyclone)；顺铂 (购于江苏豪森药业)；F12培养基(Sigma)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；噻唑蓝(MTT，Amresco)。

1.2方法

1.2.1益肺解毒方药物血清制备将60只SD大鼠编号，随机分为高、中、低剂量组及空白血清组，每组15只。给药剂量分别为96、48、24 g·kg-1·d-1及等体积生理盐水。每日进行两次灌胃、持续灌胃达3 d。于末次给药后2 h行腹主动脉取血，血液于室温下静置45 min，离心15 min，然后将同组血清收集、混匀，置于恒温(56℃)水箱中，灭活30 min，使用微孔滤膜(0.22 μm)行过滤除菌，然后进行分装，保存在-20℃冰箱内。

1.2.2MTT法检测应用MTT法检测单独应用益肺解毒方药物血清和顺铂人肺腺癌A549细胞增殖能力的影响及两者联合应用后对A549细胞增殖能力的影响。实验将益肺解毒方组分为3个剂量组(低、中、高剂量组)、空白血清组、顺铂组、联合组(低、中、高剂量益肺解毒方与空白血清联合顺铂)。将顺铂设为5个浓度梯度(1、2、4、8、16 mg/L)。另设空白对照组、空白调零组。每组设6个复孔，实验重复3次。计算各组对人肺腺癌A549细胞增殖抑制率。抑制率=1-(实验组OD值-空白调零组OD值)/(空白对照组OD值-空白调零组OD值)×100%〔3〕。用对数法计算顺铂的半抑制浓度(IC50)。按照金氏公式〔4〕判断两药协同效应：拮抗、相加或增强。求q值，q=E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)〔5〕，E(A+B) 表示两药合用的抑制率；EA、EB为两药分别使用时的抑制率。若q值<0.85为两药联合具有拮抗效应；>1.15为两药联合具有增强效应；1.15～0.85为两药联合具有相加效应。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

空白对照组与空白血清组人肺腺癌A549细胞OD值比较无统计学差异(P>0.05)，说明空白血清作用于人肺腺癌A549细胞后，对其增殖无影响。低、中、高剂量组OD值与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。顺铂对肺腺癌A549细胞增殖具有抑制作用，并在一定范围呈现浓度依赖效应。低、中、高剂量组及空白血清组与不同浓度顺铂联合应用后，对人肺腺癌A549细胞的抑制率均较单纯顺铂组提高。但空白血清协同顺铂组与顺铂组比较无统计学意义(P>0.05)。低、中、高剂量益肺解毒方药物血清联合顺铂与单纯顺铂组比较有统计学差异(P<0.05)。低剂量益肺解毒方药物血清联合顺铂组q值为0.91～1.13，提示协同效应为单纯相加。而中、高剂量益肺解毒方药物血清联合顺铂组q值多>1.15，提示协同效应为增强，其中高剂量益肺解毒方药物血清与顺铂协同增效作用最强。见表1，图1。

表1 益肺解毒方对人肺腺癌A549细胞增殖作用的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05

图1 益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

3 讨论

肺癌的病因及病机是正虚为本，邪实为标。正虚者又以气虚及阴虚两证型多见，约占80%〔6〕，实则气滞、血瘀、痰阻、热毒之病理变化。中医认为化疗药物是一种热毒，化学治疗是一种以毒攻毒的治疗方法，耗伤正气，损耗阴液，致机体气阴两虚，因此，确立了益气养阴、清热解毒的治疗方法。该方针对肺癌的病因、病机和症候特点制定，是长期临床实践的成果。先期联合化疗治疗老年晚期非小细胞肺癌，研究结果发现益肺解毒方加化疗组缓解率为31.82%，而单纯化疗组仅为15%，其病灶稳定率为77.27%，而化疗组为40%。化疗组血液毒性不良反应的发生率为28%，化疗加中药组为19%，远处转移率亦较化疗组降低，1、2、3年生存率明显提高，生存质量评分亦明显大于单纯化疗组〔2，7〕，表明益肺解毒方具有稳定病灶，缓解症状，抑制肿瘤远处转移，改善生存质量，延长生存期，提高生存率，而且其毒性低、不良反应较少，与化疗药物协同具有显著的增效减毒作用。益肺解毒方为一复方制剂，成分极其复杂，药物经煎煮及口服吸收等一系列变化，有的药物是药物本身物质发挥作用，有的是通过代谢产物发挥作用，机制不同。

因此通过直接提取中药后得到的粗提取物进行体外实验并且进一步做药物评价并不科学准确。血清药理学的实验方法为先将药物应用于动物，待药物进入动物体内到达血液系统，取其血清，将动物血清作为药物源来进行药理学观察〔8～10〕。本研究结果表明，益肺解毒方含药血清可以抑制肺腺癌A549细胞的增殖，并且当其与顺铂联合后，抑制率较单纯顺铂组明显提高，表明两者合用具有显著协同增效作用。

1林森.大数据解读癌症〔J〕.百科知识，2016；(8)：4-7.

2孙玺媛，梁隽婷，姜梅，等.益肺解毒方对老年晚期肺癌患者生存质量的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2012；39(11)：2176-8.

3朱达坚.姜黄素与伊立替康对结直肠癌lovo细胞的协同作用及其机制研究〔D〕.广州：南方医科大学，2014.

4金正均.论 Lineweaver-burk直线化公式的应用〔J〕.中国药理学报，1980；1(1)：3-5.

5陈红专，孙琛，俞霭瑶，等.赖氨酸锗和环磷酰胺合用对小鼠S-180肉瘤抑制作用〔J〕.中国药理学通报，1991；7(1)：32-5.

6刘嘉湘.辩证治疗原发性肺癌310例疗效分析〔J〕.上海中医药杂志，1985；(10)：3-5.

7孙玺媛，梁隽婷，李松，等.中医辨证联合第三代细胞毒单药治疗老年晚期非小细胞肺癌22例〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(18)：4526-7.

8陈宁，宋冬雪，凌娜，等.中药血清药理学方法的研究进展〔J〕.北京联合大学学报(自然科学版)，2014；28(1)：40-3.

9陈钱，黄成然，陈凯，等.血清药理学方法应用的研究进展〔J〕.吉林医药学院学报，2015；36(1)：65-8.

10林慧，梅全喜.单味中药及其复方制剂抗肿瘤血清药理学研究进展〔J〕.中国药房，2016；27(4)：550-2.

〔2016-10-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)