刘月英 郭宪民 李 波 卢 佳

(香港大学深圳医院，广东 深圳 518000)

依达拉奉对急性肺损伤大鼠肺组织凋亡的影响

刘月英 郭宪民1李 波2卢 佳3

(香港大学深圳医院，广东 深圳 518000)

目的探讨依达拉奉治疗急性肺损伤(ALI)大鼠的作用及其机制。方法将48只清洁级Wistar成年大鼠随机分为对照组、ALI组和依达拉奉(EDA)组，之后给予EDA治疗。治疗后第7天留取肺脏组织，行苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织形态，Western印迹和免疫组织化学法检测肺组织Bcl-2和Bax表达。结果HE染色显示ALI组肺组织表现肺结构部分破坏，肺泡部分肺泡壁塌陷且水肿严重，部分肺泡腔扩大，大量炎性细胞浸润，肺泡隔显著增厚，明显的局部出血；与ALI组相比，EDA组肺组织结构破坏较轻，水肿也明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润。Western印迹结果显示，与ALI组相比，EDA组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显增高，促凋亡蛋白Bax表达水平显著降低，酶切-caspase3蛋白表达明显下调(均P<0.01)。免疫组化结果表明，与ALI组相比，核浆中的Bcl-2表达水平明显增高，Bax表达水平明显降低(均P<0.01)。结论EDA在ALI大鼠肺组织中上调Bcl-2和下调Bax蛋白水平来降低细胞凋亡,同时其可能通过减少Caspase3依赖途径的凋亡来保护肺组织。

急性肺损伤；依达拉奉；凋亡；脂多糖

细胞凋亡是一个被动的过程，分为外源性死亡受体通路，内源性线粒体通路和内质网应激引起的Caspase12活化通路3条途径〔1〕。内源性线粒体通路为由线粒体外膜通透性增加引起Bcl-2家族蛋白改变〔2〕。这3条通路最后都会汇集到Caspase3，引起剪切的Caspase3活化导致细胞的死亡发生〔3〕。依达拉奉(EDA)是以阴离子存在血液中，通过吸取体内自由基转移的单电子生成EDA基团，从而阻断脂质过氧化反应，避免氧化损伤的产生。研究认为EDA可以消耗中性粒细胞生成的·OH和H2O2，破坏其产生活性氧的能力〔4〕。同时也有研究认为其可以抑制神经细胞的凋亡〔5〕。在缺血性脑病大鼠模型中，EDA能抑制急性脑水肿及神经功能的损坏〔6〕。前期研究发现通过改变Bcl-2和Bax蛋白的表达，来进一步的影响凋亡执行蛋白Caspase3的表达，而细胞中Bcl-2的高表达也能影响Caspase3蛋白的表达〔7〕。本研究以急性肺损伤(ALI)大鼠为研究模型，给予EDA治疗，观察肺组织形态学的改变和肺组织中凋亡相关蛋白的表达，进一步探讨其对ALI的作用机制。

1 材料与方法

1.1药品及主要试剂 脂多糖(美国 Sigma公司)，EDA注射液(国药集团国瑞药业有限公司)，Bcl-2、Bax和caspase3抗体及SP免疫组化试剂盒(北京博奥森生物科技有限公司)。

1.2实验动物及分组 健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，体质量(250±10)g，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2008-0005。本研究选用一次性给予5 mg/kg 脂多糖静脉注射制造大鼠ALI模型。随机分为ALI组和EDA组，之后选取一次性给予5 ml生理盐水静脉注射为对照组。对照组一次性灌胃1 ml生理盐水；2次/d腹腔注射1 ml生理盐水。ALI一次性给予5 mg/kg脂多糖静脉注射。EDA组，一次性给予5 mg/kg脂多糖静脉注射造模后，之后腹腔注射0.5 mg·kg-1·d-1EDA腹腔注射。治疗7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取肺组织-80℃保存。同时右肺中叶应用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后进行脱水、浸蜡、包埋、切片等过程，最后给予苏木素-伊红(HE)染色。冷冻肺组织行蛋白质免疫印迹试验。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3HE观察肺组织形态学 取肺组织切片，经脱蜡、HE染色、梯度乙醇脱水、透明、封固的阳性细胞光镜下观察。

1.4免疫组化 采用北京博奥森生物科技有限公司SP组化试剂盒。

1.5Western印迹检测肺组织Bcl-2和Bax蛋白表达 提取肺组织总蛋白，Bio-Rad 法测定蛋白浓度，给予Western印迹实验。显色结束后，膜拍照封存，并做好记录。用Image J图像处理软件计算各条豆类灰度值，分析Bax、Bcl-2和Capase3蛋白的表达情况蛋白的表达情况。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1HE染色结果 对照组大鼠肺组织结构清晰且肺泡壁厚度均匀，肺泡隔结构正常。ALI组肺组织表现肺结构部分破坏，肺泡壁塌陷且水肿严重，部分肺泡腔扩大，大量炎性细胞浸润，肺泡隔显著增厚，明显的局部出血；与ALI组相比，EDA组肺组织结构破坏较轻，肺泡隔厚度降低，水肿也明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润，见图1。

2.2Western印迹法检测急性肺损伤大鼠肺组织中凋亡相关蛋白的表达 与对照组相比，ALI组Bcl-2蛋白表达明显降低、Bax蛋白表达明显增高(P<0.01)；EDA组Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，但是Bax蛋白没有明显变化。与ALI组相比，EDA组Bcl-2蛋白表达明显增加，Bax蛋白表达明显降低(P<0.01)，见图2。对照组肺组织中酶切-Caspase3蛋白没有表达，但在ALI组中明显增高(P<0.01)，经过EDA治疗后，酶切-Caspase3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见图3。

图1 EPI治疗ALI大鼠肺组织HE染色(×40)

图2 ALI大鼠肺组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达

图3 Western印迹检测急性肺损伤大鼠的 肺组织中Caspase蛋白的表达(×40)

2.3免疫组化法检测ALI大鼠肺组织中Bcl-2和Bax蛋白表达结果 对照组Bcl-2蛋白在核浆中表达，在胞质和细胞膜中没有表达，而Bax蛋白在正常的肺组织中没有表达。ALI组核浆中Bcl-2的表达水平明显降低，同样在胞质和细胞膜中也没有表达，Bax蛋白在核浆中的表达明显增加，细胞质中表达水平明显上调。在经过EDA治疗后，Bcl-2在核浆中的表达水平明显增高，同时在胞质中有少许的Bcl-2的表达。Bax在核浆中表达水平明显降低，但是胞质中的Bax没有表达，见图4，5。

图4 免疫组化检测急性肺损伤 大鼠的肺组织中Bcl-2蛋白的表达(×40)

图5 免疫组化检测ALI 大鼠肺组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达(×40)

3 讨 论

ALI是指由感染、休克、化学性吸入和创伤等引起的弥漫性肺毛细血管内皮细胞和上皮细胞损伤所致的渗透性水肿和低氧血症为主的临床症状疾病。如果不及时治疗，可能发展为急性呼吸窘迫综合征〔7〕。如果外部刺激因素不变或内部影响因素不给予干预，通常会引起更快的病情进展。伍俊峰〔8〕也曾经用过脂多糖制作大鼠ALI模型，其通过检测了大鼠的血气分析相关指标和测量肺湿重等临床指标来确认造模成功，之后也通过HE染色来确认大鼠肺组织出现水肿。

本研究结果说明在ALI大鼠肺组织中，细胞的凋亡水平为促凋亡大于抗凋亡，细胞表现为凋亡持续状态。免疫组化法证明了ALI大鼠肺组织处于凋亡持续状态。在经过EDA治疗后，细胞的凋亡水平为抗凋亡大于促凋亡，细胞表现为抗凋亡状态。说明EDA能提高细胞的抗凋亡水平。免疫组化法也证明依达拉奉对急性肺损伤大鼠肺的治疗作用。研究发现了细胞可以通过改Bcl-2和Bax蛋白的表达，来进一步影响凋亡执行蛋白Caspase3的表达，而细胞中Bcl-2的高表达也能影响Caspase3蛋白的表达〔9〕。本研究结果说明EDA可以有效抑制ALI大鼠肺细胞凋亡的发生。

1Bhola PD,Letai A.Mitochondria-judges and executioners of cell death sentences〔J〕.Mol Cell,2016;61(5):695-704.

2Pandey MK,Prasad S,Tyagi AK,etal.Targeting cell survival proteins for cancer cell death〔J〕.Pharmaceuticals(Basel),2016;9(1):Pii:E11.

3Green DR,Llambi F.Cell death signaling〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol,2015;7(12):pii:a006080.

4Feng S,Yang Q,Liu M,etal.Edaravone for acute ischaemic stroke〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2011;7(12):CD007230.

5Yang J,Liu M,Zhou J,etal.Edaravone for acute intracerebral haemorrhage〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2011;16(2):CD007755.

6Higashi Y.Edaravone for the treatment of acute cerebral infarction:role of endothelium-derived nitric oxide and oxidative stress〔J〕.Expert Opin Pharmacother,2009;10(2):323-31.

7Millar FR,Summers C,Griffiths MJ,etal.The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome:insights and therapeutic opportunities〔J〕.Thorax,2016;71(5):462-73.

8伍俊峰.依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用及分子机制研究〔D〕.杭州：浙江大学，2009.

9杨 申.P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表达及其学习记忆能力的影响〔D〕.济南：山东大学，2013.

〔2017-03-25修回〕

(编辑 李相军)

R332.2

A

1005-9202(2017)18-4482-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.022

吉林省卫生计生委(2015SZC13)

1 吉林大学第一医院 2 吉林大学基础医学院

3 吉林大学中日联谊医院

卢 佳(1979-)，女，主任医师，主要从事角膜病及肿瘤分子生物学研究。

刘月英(1977-)，女，副主任医师，主要从事重症医学研究。