李蒙蒙 吴晓光 赵星龙 尹美娟 梁 禅 江思瑜 姜俞忻 李素环

(承德医学院基础医学研究所 河北省中医药抗痴呆重点研究室,河北 承德 067000)

慢性脑缺血大鼠脑组织NogoA、NgR1蛋白表达及山楂叶总黄酮的干预作用

李蒙蒙1吴晓光 赵星龙1尹美娟1梁 禅1江思瑜1姜俞忻 李素环1

(承德医学院基础医学研究所 河北省中医药抗痴呆重点研究室,河北 承德 067000)

目的探讨山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠脑组织轴突过度再生抑制因子(Nogo)A及其受体NgR1表达的影响。方法健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、慢性脑缺血模型组、山楂叶总黄酮组和银杏叶片组。采用双侧颈总动脉永久性双重结扎法建立慢性脑缺血模型。HE染色法观察神经元密度；Western印迹和免疫组化法检测缺血脑组织NogoA和NgR1蛋白的表达。结果与假手术组海马神经细胞比较，模型组大鼠CA1区神经细胞排列混乱，神经元细胞间隙增大，部分细胞溶解消失，细胞核固缩、浓染，正常神经元数量较假手术组减少(P<0.01)，脑组织内Nogo A(P<0.01)和NgR1(P<0.05)蛋白表达升高；与模型组比较，山楂叶总黄酮组病变明显减轻，正常的神经细胞排列规则，结构较完整，神经元密度增加(P<0.05)， Nogo A(P<0.01)和NgR1(P<0.05)蛋白表达降低。结论山楂叶总黄酮具有下调Nogo A和NgR1蛋白表达，促进脑神经元轴突再生，保护慢性脑缺血大鼠神经的功能。

山楂叶总黄酮；慢性脑缺血；NogoA；NgR1

在中枢神经系统中，神经元的生长和抑制处于相对平衡的状态，故其损伤后该平衡被破坏，即可导致神经功能障碍〔1〕。脑缺血损伤后神经元再生能力很弱，主要是由于微环境中生长支持因子的缺乏和多种抑制因子的存在，阻碍了中枢神经轴突的再生过程。轴突过度再生抑制因子(Nogo)A及其受体NgR1的存在是中枢神经系统轴突再生的主要障碍之一〔2〕。本课题组研究表明，山楂叶总黄酮具有抗氧化〔3〕，减轻炎症反应〔4〕，抑制胆碱酯酶活性〔5〕等脑保护作用，但对NogoA及其受体NgR1表达的影响未见报道。本实验观察大鼠缺血脑组织中NogoA及其受体NgR1表达的变化，探讨山楂叶总黄酮对慢性缺血脑组织神经再生的影响。

1 材料与方法

1.1动物与分组 清洁级雄性SD大鼠48只，体质量230～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证：scxk(京)2014-0004。适应饲养1 w后随机分为假手术组、模型组、山楂叶总黄酮组和银杏叶片组，每组12只。

1.2药物与试剂 山楂叶总黄酮购于承德复康药业有限公司，纯度58%，用0.5%碳酸氢钠溶液稀释为140 mg/ml。Nogo-A多克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供；NgR1由Santa Cruz公司提供；SABC二抗试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒由武汉博士德生物科技有限公司提供。

1.3动物模型制备及给药 采用永久性双侧颈总动脉结扎法对模型组、山楂叶总黄酮组和银杏叶片组的大鼠制备慢性脑缺血模型：3.5%水合氯醛腹腔麻醉，颈正中切口，无创伤镊子钝性分离皮下组织及下颌下腺，玻璃分针分离双侧颈总动脉，双线结扎并用电刀切断颈总动脉防止复流，碘伏消毒后，缝合切口，每只大鼠腹腔注射10万U青霉素1次，预防感染。术后24 h内未苏醒者剔除，并及时补遗。假手术组的大鼠仅用玻璃分针游离双侧颈总动脉，不做结扎处理。术后第30天开始，山楂叶总黄酮组给予山楂叶黄酮140 mg·kg-1·d-1灌胃，银杏叶片组给予银杏叶提取物6.5 mg·kg-1·d-1灌胃，连续30 d。假手术组及模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。

1.4取材及指标检测 末次给药1 h，每组随机取6只大鼠，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心室灌注固定，取视交叉后段脑组织，10%甲醛后固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，莱卡石蜡切片机连续5 μm冠状切片备用。

1.4.1HE染色法观察神经元密度 5 μm石蜡切片，常规二甲苯脱蜡10 min，下行梯度酒精浸水各5 min，苏木精染色3 min，盐酸酒精分色15 s，伊红染色1 min，上行梯度酒精脱水各5 min，二甲苯透明10 min，中性树胶封片，光镜观察海马神经元形态及密度的变化。

1.4.2Western印迹法检测NogoA蛋白的表达 末次给药后1 h，每组余下的6只，断头取脑，剥离软脑膜和血管，取视交叉后2～8 mm之间的脑组织，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗净血液，加入裂解液和10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)(10 mg/ml)，4 ℃匀浆，10 000 r/min，离心30 min,取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。再经过SDS-PAGE电泳、转膜、10% 脱脂奶粉封闭，加NogoA一抗(1∶150)4℃过夜，HRP标记的二抗(1∶1 000)室温孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏发光液发光，X线片暗盒内曝光，D72显影液显影，利用Quantity One软件分析X线胶片的灰度值。

1.4.3免疫组化法检测NgR1蛋白表达 各组大鼠脑组织石蜡切片中每隔5片取1片，每个组织选3片，二甲苯脱蜡，梯度酒精浸水，3%H2O2孵育10 min，枸橼酸缓冲液微波抗原修复；滴加NgR1单克隆抗体(1∶200稀释)，4℃冰箱孵育过夜；加二抗工作液，室温孵育30 min；滴加SABC酶标液孵育30 min；DAB显色10 min；苏木精复染5 min；盐酸酒精分色15 s，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。奥林巴斯显微镜400倍镜下摄片，每张切片随机选5个视野，采用MiVnt图像分析仪分析阳性表达的吸光度值。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠海马CA1区神经元形态及密度的变化 HE染色显示，假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列较整齐，细胞核呈圆形，染色较浅，核仁清晰可见；模型组大鼠海马CA1区细胞排列不规则，神经元细胞间隙增大，部分细胞溶解消失，细胞核固缩、浓染，正常神经元数量较假手术组显著减少(P<0.01)；与模型组比较，山楂叶总黄酮组及银杏叶片组病变明显减轻，正常神经元数量明显增多，排列稍规则，结构较清晰，神经元密度显著增加(P<0.05)，山楂叶总黄酮组与银杏叶片组之间无显著差异(P>0.05)。见图1，表1。

图1 各组大鼠海马CA1区神经元密度的变化(HE，×400)

组别神经元密度(mm2)神经元脱失率(%)假手术组66.46±9.230模型组13.51±6.341)79.67±33.201)山楂叶总黄酮组34.93±7.622)47.44±12.813)银杏叶片组36.56±5.732)44.98±13.563)

与假手术组比较:1)P<0.01;与模型组比较:2)P<0.05,3)P<0.01，下表同

2.2各组大鼠NogoA蛋白表达的变化 与假手术组比较，模型组NogoA蛋白的表达显著升高〔(364.89±5.19)%，P<0.01〕；与模型组比较，山楂叶总黄酮组和银杏叶片组的NogoA蛋白的表达分别降低了(60.47±5.93)%和(62.63±6.39)%，差异有统计学意义(P<0.01)；银杏叶片组优于山楂叶总黄酮组，但两组间比较无统计学差异(P>0.05)。见图2，表2。

2.3各组大鼠NgR1蛋白表达的变化 神经元的细胞膜及胞质内出现棕黄色颗粒为NgR1阳性表达。假手术组大鼠神经元NgR1出现弱阳性表达；与假手术组比较，模型组大鼠神经元NgR1阳性表达的数量显著增加；与模型组比较，山楂叶总黄酮组大鼠NgR1阳性表达的神经元数量明显减少。模型组大鼠NgR1的吸光度值高于假手术组(P<0.01)；与模型组比较，山楂叶总黄酮组大鼠NgR1的吸光度值显著降低(P<0.05)，提示山楂叶总黄酮具有抑制NgR1蛋白表达的作用。见表2。

图2 各组大鼠脑组织NogoA蛋白表达的变化

组别NogoANgR1(OD值)假手术组0.0109±0.000340.82±0.15模型组0.0463±0.005811)0.31±0.041)山楂叶总黄酮组0.0183±0.000543)0.68±0.082)银杏叶片组0.0173±0.000513)0.67±0.072)

3 讨 论

中枢神经元坏死及轴突脱髓鞘坏死是导致患者丧失原有神经功能的主要原因。脑缺血激活了级联反应，导致缺血半暗带逐渐消失，坏死的脑组织区域增大，如何在脑部缺血性损伤后采取积极有效的治疗措施抢救缺血半暗带并减少脑组织的死亡区域，是提高脑梗死后患者生命质量的关键〔6〕。中枢神经系统损伤后修复是目前神经医学研究的重点和难点，迄今仍然缺乏有效的治疗方法和手段。其中一个重要原因是存在髓鞘源性轴突生长抑制因子，通过与分布在轴突生长锥表面的NgR受体复合物结合抑制轴突再生〔2〕。因此，能否有效解除抑制中枢神经再生的因素，是脑梗死后神经功能恢复的重要环节。近年研究发现，在神经发育阶段，Nogo-A-NgR系统存在帮助建立稳定的髓鞘通道，引导轴突向着正确的方向延伸以及介导神经元之间建立联系而形成突触等作用〔7〕。

NogoA是一个含有1 163个氨基酸的膜蛋白(分子量接近200 kD)，主要在中枢神经系统的少突胶质细胞和神经元髓鞘内外环中表达，身体发育期间神经元中亦有一定程度的表达，但成年后就几乎不在神经元中表达〔8〕。NogoA的受体包括 NgR1、NgR2 和 NgR3，其中NgR1与NogoA的结合力最强〔9〕。有研究认为，NogoA抑制神经再生的作用主要是通过与其受体NgR-p75NTR复合物结合，从而激活细胞内RhoA信号通路，使生长锥崩解并抑制轴突延伸〔10〕。再通过第二信使作用于Rho进而激活 ROCK，调节生长锥中的微丝，使生长锥崩溃，抑制轴突再生〔11〕。本实验结果显示，慢性脑缺血可引起胶质细胞过度活化，释放NogoA蛋白，继而与其受体NgR1结合，抑制神经再生，损伤脑的神经功能，与文献报道的结果一致〔12〕。本课题组前期研究结果也显示山楂叶总黄酮能够抑制脑缺血后胶质细胞过度表达，减少胶质瘢痕形成的作用〔13〕。山楂叶总黄酮药物干预后，NogoA及其受体NgR1表达显著减少，提示山楂叶总黄酮能抑制脑缺血诱发的NogoA及其受体NgR1过度表达，这可能是其对脑保护作用的机制之一。

1Gu H,Yu SP,Gutekunst CA,etal.Inhibition of the Rho signaling pathway improves neurite outgrowth and neuronal differentiation of mouse neural stem cells〔J〕.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2013；5(1):11-20.

2Stanwick JC,Baumann MD,Shoichet MS.In vitro sustained release of bioactive anti-NogoA,a molecule in clinical development for treatment of spinal cord injury〔J〕.Int J Pharmaceut,2012;426(2):284-90.

3张天鸽，李蒙蒙，吴晓光.山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠脑组织氧化应激损伤的影响〔J〕.承德医学院学报，2014;31(6):538-9.

4吴晓光，苗光新，万自旭，等.山楂叶总黄酮对慢性脑缺血大鼠轴突过度再生抑制因子A及其受体表达的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2015;17(2):1314-7.

5苗光新，毛晓霞，吴晓光，等.山楂叶总黄酮对血管性痴呆大鼠脑内胆碱能活性及学习记忆的影响〔J〕.解剖学杂志，2014;37(2):192-5.

6凌 敬.通窍活血汤加减治疗急性脑梗死的疗效观察〔J〕.世界中医药，2013;8(3)：303-5.

7赵 修，宋锦宁，郗 磊，等.大鼠弥漫性轴索损伤后Nogo-A在脑组织中表达的分布与动态变化及其意义〔J〕.西安交通大学学报，2015;36(1)：80-4.

8刘振东.NogoA受体拮抗剂(No9066/NEPl-40)参与大鼠局灶性脑缺血模型神经修复的实验研究〔D〕.大连：大连医科大学，2012.

9Fan HE，Fang QU，Fulin S.Aspirin upregulates the expression of neuregulin 1 and survivin after focal cerebral ischem ia/reperfusion in rats〔J〕.Exp Therap Med,2012;3(4):613-6.

10张 哲,廖 红,严 峻,等.NgR1在中枢神经系统疾病中的作用研究进展〔J〕.神经损伤与功能重建,2013;8(4):289-92.

11Zhao SH，Zhao M,Xiao T，etal.Constraint induced movement therapy overcomes the intrinsic axonalgrow th inhibitory signals in stroke rats〔J〕.Stroke,2013;44(6):1698-705.

12刘 炜,刘丽星,史晓伟,等.三七总皂苷对局灶性脑梗死大鼠海马CA1区NogoA/NgR1/RhoA信号通路蛋白表达的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2013;8(4):1370-3.

13封献敬,曹娜娜,檀荣方,等.山楂叶总黄酮对大鼠慢性脑缺血时星形胶质细胞GFAP表达的影响〔J〕.承德医学院学报，2013;30(6):532-3.

〔2016-04-13修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R749

A

1005-9202(2017)18-4478-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.020

河北省科技厅指令课题(No.15277789D)；河北省教育厅青年基金指令课题(No.QN2014103)；河北省高校省级重点学科项目(No.2013-2016);河北省中医药抗痴呆重点研究室项目(No.2014-2017);承德医学院大学生科研重点课题(No.201505)

1 承德医学院基础医学院2012级麻醉本科

吴晓光(1975-)，男，副研究员，硕士，硕士生导师，主要从事中医药抗痴呆机制研究。

李蒙蒙(1991-)，女，主要从事神经损伤与修复研究。