马志云 宫 亮 王雪峰

(辽宁医学院附属第一医院耳鼻喉科，辽宁 锦州 121001)

胰岛素样生长因子-1抑制庆大霉素引起的小鼠耳蜗毛细胞凋亡

马志云 宫 亮 王雪峰

(辽宁医学院附属第一医院耳鼻喉科，辽宁 锦州 121001)

目的探讨胰岛素样生长因子(IGF)-1是否通过Notch信号通路抑制庆大霉素(GM)引起的离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡。方法体外培养新生小鼠耳蜗基底膜，在分别含有正常对照培养液(A组)、0.5 mmol/L GM(B组)、0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C组)的成分中培养24 h后收集细胞及固定。应用TUNEL法观察各组耳蜗毛细胞的凋亡情况。应用Western印迹、实时定量聚合酶链反应(PCR)观察各组小鼠基底膜Notch2/hes1信号通路的表达量。结果A组观察到少量凋亡毛细胞，B组耳蜗毛细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较A组明显上升(P<0.01)，C组细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较B组明显下降(P<0.01)。结论IGF-1通过抑制Notch2/hes1信号通路，减少GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡。

胰岛素样生长因子-1；Notch2/hes1信号通路；耳蜗毛细胞；凋亡

胰岛素样生长因子(IGF)-1广泛存在于动物体内，促进细胞增殖并抑制凋亡。IGF-1在噪声暴露、缺血再灌注、氨基糖苷类药物损伤中可保护耳蜗，减少毛细胞凋亡，但其在耳蜗生长发育、抑制毛细胞凋亡中具体保护作用机制尚不明确〔1～3〕。Notch信号通路是在细胞增殖和凋亡中反复参与调节的少数信号转导系统之一，控制细胞在内在或外在环境变化时的发展方向，影响细胞分化、增殖、凋亡程序〔4〕。本实验观察Notch2/hes1信号通路表达的变化以明确IGF-1是否通过Notch2/hes1蛋白信号通路调控GM诱导的离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取12只新生4 d健康昆明小鼠(24耳)，采用随机数字表法分为3组，离体培养小鼠耳蜗基底膜：8个耳蜗作为正常对照组(A组)；8个耳蜗置于0.5 mmol/L GM培养液中(B组)；8个耳蜗置于0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C组)。48 h后收集细胞。

1.2主要仪器及试剂 胎牛血清及DMEM培养基(美国Gibco公司)；TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)；实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(美国Qiagen公司)；TUNEL检测试剂盒(美国R&D公司)；抗Notch2/hes1抗体及二抗(英国Abcam公司)。激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510M，德国)。

1.3TUNEL染色检测凋亡毛细胞 采用新生昆明小鼠耳蜗器官离体培养技术〔5〕，制作各组耳蜗组织铺片；加用荧光素(FITC)标记的TUNEL反应混合液；阴性对照为省去TUNEL的反应液。对各组毛细胞进行染色，经4%多聚甲醛固定，红色荧光标记细胞为TUNEL染色阳性结果。

1.4激光共聚焦显微镜观察 以相应波长(FITC 为514 nm，cy3为554 nm，cy5为610 nm)激光激发后，目镜上配计数格，在激光共聚焦显微镜下分别于各组耳蜗铺片随机选取相互不重复的4个视野，在400倍物镜下计数每视野红色荧光标记的凋亡细胞数，并进行定量分析。

1.5Notch2/hes1蛋白表达检测 耳蜗总蛋白中Notch2/hes1蛋白的表达采用Western印迹技术检测：将总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后(每一样本均含总蛋白60 μg)，转印至硝酸纤维素膜上，应用增强化学发光法检测Notch2/hes1蛋白的表达。选用兔抗Notch2/hes1及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体。胶片分析时运用HPlsA 1000图文分析系统，Notch2/hes1蛋白的相对表达水平用灰度值表示。

1.6Notch2/hes1基因表达检测 Notch2 mRNA/hes1 mRNA的表达参照Trizol Reagent说明书操作，采用Access RT-PCR系统将由耳蜗组织提取的总RNA 1 μg一步法扩增成DNA目的片段。反应循环参数为：48℃ 45 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。Notch2引物序列：上游序列为5′CCTGAACGGGCAGTACATTT3′，下游序列为5′GCGTAGCCCTTCAGACACTC3′，目的片段为165 bp。hes1引物序列：上游序列5′CCCACCTCTCTCTTCTGACG3′，下游序列为5′AGGCGCAATCCAATATGAAC3′，目的片段为185 bp。内参照β-actin，上游序列为5′ACGTTGACATCCGTAAAGAC3′，下游序列为5′GAAGGTGGACAGTGAGGC3′，目的片段为520 bp。用Notch2/hes1与β-actin灰度比值表示Notch2 mRNA/hes1 mRNA相对表达水平。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行F检验，两组间差异比较运用SNK法。

2 结 果

2.1各组凋亡毛细胞 A组观察到少量凋亡细胞，凋亡率(1.36±0.98)%；B组凋亡率(16.15±1.07)%较A组明显增多(P<0.05)；C组凋亡率(12.11±1.31)%较B组明显减少，与A组差异亦有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组耳蜗铺片凋亡细胞(箭头指示，×400)

2.2各组耳蜗毛细胞Notch2/hes1蛋白及mRNA相对表达量 加药处理48 h后，Notch2/hes1蛋白及mRNA表达B组较A组明显增高(P<0.01)；C组较B组明显减少(P<0.05)。Western印迹结果见图2，RT-PCR结果见图3和表1。

图2 各组Notch 2、hes1及β-actin 蛋白条带图

图3 各组Notch2和hes1 mRNA表达

组别Notch2蛋白Notch2mRNAhes1蛋白hes1mRNAA组0.254±0.1430.231±0.1200.217±0.1760.216±0.190B组0.557±0.2601)0.576±0.1101)0.312±0.1631)0.365±0.2901)C组0.304±0.1062)0.375±0.0802)0.232±0.1592)0.245±0.1102)

与A组相比：1)P<0.05；与B组相比：2)P<0.05

3 讨 论

IGF-1 是一种活性单链多肽物质，以往研究表明，敲除IGF-1基因的鼠耳蜗生长分化和成熟受到严重影响，且出现明显听力下降〔6〕。Yamamoto等〔3〕在氨基糖苷类耳毒性离体基底膜中应用IGF-1，同时观察到了支持细胞周期的激活和毛细胞凋亡的抑制。陈冬等〔7〕发现IGF-1对GM引起的离体耳蜗毛细胞凋亡的保护作用有明显的浓度依赖特点，其中10 ng/ml IGF-1为最佳保护浓度。研究表明IGF-1对耳蜗毛细胞的保护作用可能通过Wnt通路调节〔8〕。最新研究证明IGF-1可以抑制氨基糖苷类药物损伤诱导的毛细胞凋亡，并观察到分裂原活化抑制剂(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路的激活，但具体保护作用机制目前尚不清楚〔9〕。Yamahara等〔10〕在人工耳蜗外植体培养系研究中发现，可用IGF-1来维持毛细胞数量，认为IGF-1可抑制毛细胞凋亡并可促进支持细胞的增殖。Notch信号通路是在细胞增殖和凋亡中少数反复参与调节的信号转导系统，在多细胞机体细胞凋亡、增殖和分化方面有重要作用。目前Notch信号通路在肿瘤细胞的增殖与凋亡等领域研究较深入，但在耳蜗毛细胞的凋亡方面研究较少〔11〕。

Notch信号转导途径包括Notch受体、Notch配体〔Delta/Serrate/Lag2(DSL)蛋白，哺乳动物为Jagged蛋白〕、细胞内效应分子(CSL蛋白)、DNA结合蛋白(RBP-J)、其他的效应物及Notch的调节分子等。下游靶基因如Hes1、Hes5等转录因子家族与CSL结合后大量表达，进而影响细胞的分化、增殖与凋亡〔12〕。作为Notch受体的靶基因之一，Hes1表达转录的hes1蛋白是一种转录抑制因子，基本结构为碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)。在Hes1基因突变小鼠耳蜗可观察到明显增多的耳蜗内毛细胞，而缺失Hes1基因则会发现椭圆囊或球囊有额外的毛细胞产生〔13〕。研究发现，激活不同的Notch受体会产生不同的作用，其中Notch2通过hes1起作用〔14〕。本实验说明GM可以诱导离体培养的毛细胞凋亡，与前人研究结果一致〔7，8，10〕；Notch2/hes1信号通路在GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡过程中被激活。研究表明，肿瘤坏死因子(TNF)信号可通过激活Notch2，并上调其表达量，然后通过调节控制凋亡的关键调节剂而诱发细胞凋亡〔11〕。Batts等〔15〕运用卡那霉素制造豚鼠耳毒性模型，在毛细胞损伤24 h后运用Western印迹和免疫组化技术分析显示，参与激活Notch通路的蛋白增加，存活的支持细胞中所有Notch信号组分(包括Notch2和hes1)都是上调的。这些结果提示哺乳动物的听觉细胞在受到损伤后仍具有短暂调节Notch信号和hes基因活性的能力。这与本研究结果一致。本实验结果说明IGF-1可以减少GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡。GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡模型中加入IGF-1后Notch2/hes1信号通路被抑制。在内耳发育早期，Wnt信号通路和Notch信号通路均参与听板发育的调节，且可相互调节〔16〕。Wnt信号可以调节Notch信号通路中Jag1配体基因、Notch1受体基因和下游靶基因Hes1等基因的表达，反过来Notch信号也能促进Wnt信号通路中相关基因的表达。因此，IGF-1很可能通过Notch2/hes1信号通路保护GM诱导的耳蜗毛细胞凋亡，但具体作用位置、是否与Wnt通路存在联通机制尚不清楚。黄飞等〔17〕在GM耳毒性离体基底膜培养时加入γ-分泌酶抑制剂(DAPT)，发现Notch2/hes1信号通路表达降低，认为DAPT可能通过抑制此通路而减轻毛细胞损伤。因此，在进一步研究中，可用Notch2/hes1基因缺陷小鼠进一步验证本实验结果，并找出IGF-1在此通路的具体作用部位。

综上，IGF-1对耳蜗的保护作用可能是通过抑制Notch2/hes1信号通路而减轻GM诱导的毛细胞凋亡。人类毛细胞损伤后不可再生，Yamahara等〔10〕在人工耳蜗外植体培养系研究中应用IGF-1，发现IGF-1是维持现有毛细胞数量并促进支持细胞再生的新方法。最新临床试验证明，通过圆窗膜应用IGF-1可改善突发性耳聋患者的听力〔18〕。Batts等〔15〕实验结果表明，哺乳动物的听觉细胞在受到损伤后仍具有短暂调节Notch信号和hes基因活性的能力。本实验为IGF-1联合人工耳蜗植入治疗重度感音神经性耳聋提供了新的理论依据。

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〔2016-09-11修回〕

(编辑 苑云杰)

R762

A

1005-9202(2017)18-4469-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.016

2014年辽宁省教育厅科学研究项目(No.L2014323)；辽宁医学院校长基金-奥鸿博泽研究生科技创新基金(No.AH2014015)

宫 亮(1980-)，男，博士在读，副主任医师，副教授，主要从事耳鼻喉疾病研究。 王雪峰(1965-)，男，博士，主任医师，主要从事耳鼻喉疾病研究。

马志云(1989-)，女，硕士，住院医师，主要从事耳鼻喉疾病研究。