携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达

2017-09-27邓守恒曹风军蔡晓军李林均

中国老年学杂志 2017年18期

关键词：线性化腺病毒同源

邓守恒胡茵曹风军蔡晓军李林均陈萍

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北十堰 442000)

携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达

邓守恒胡茵曹风军蔡晓军李林均陈萍

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心，湖北十堰 442000)

目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达。方法扩增目的基因VP3 cDNA，与EcoR Ⅴ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP，PmeⅠ酶切线性化pShuttle-VP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌，细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP，并经PCR、EcoR Ⅴ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定，线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增，CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达，观察其感染效率及VP3蛋白表达水平。结果pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功，PCR反应扩增出402 bp的片段；pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段，重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中，且其序列与GenBank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒，滴度为1.738×1012opu/ml，重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达。结论用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒，并可在人结肠癌细胞中高效表达。

同源重组；凋亡素；腺病毒；人结肠癌细胞

凋亡素VP3基因来源于鸡贫血病毒，其编码的VP3蛋白仅可诱导肿瘤细胞或转化细胞凋亡，而对正常细胞和二倍体细胞不起作用，被认为是第一个真正意义上具有选择性杀伤肿瘤的凋亡蛋白〔1，2〕。研究显示VP3蛋白发挥抗肿瘤作用与其在细胞中的定位密切相关，VP3蛋白定位于肿瘤细胞核内，通过磷酸化反应与DNA结合诱导肿瘤细胞凋亡，而在正常细胞中，VP3蛋白则定位于细胞质中不能发生磷酸化反应，基于生物膜的屏障作用，通过增加VP3蛋白的跨膜能力以增强其选择性杀伤肿瘤细胞能力成为当前的研究热点〔3，4〕。本组前期利用Pep-1穿膜肽构建的Pep-1-VP3融合蛋白理论上能够增强VP3蛋白的跨膜能力，然而，由于工程菌表达量低，表达产物有包涵体以及分离和纯化蛋白技术受限等使得制备的融合蛋白在后续研究中效果并不令人满意〔5，6〕。为解决以上难题，笔者又选用改良腺病毒作为载体，采用细菌内同源重组法构建携带VP3基因的重组腺病毒并作用于体外培养的人结肠癌细胞株SW480，观察其透膜及表达情况。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 SW480及AD293细胞、PET15b-VP3重组质粒、腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP、感受态大肠杆菌DH5α和超感受态大肠杆菌BJ5183、pfuDNA聚合酶，EcoR Ⅴ、PmeⅠ、PacⅠ、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)均由湖北医药学院临床医学研究所提供；超速冷冻离心机(HCP80MX，日本)、PCR仪(Biometra，德国)、凝胶图像分析系统(Touching 995gel document system，上海)。

1.3pShuttle-VP3-GFP重组穿梭质粒的构建及鉴定采用定向同源重组法连接经EcoR Ⅴ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒和含VP3基因 PCR扩增产物，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α后行PCR鉴定，鉴定体系为：50×dNTP(10 mmol/L)1 μl，10倍缓冲液5 μl，10×上游引物P1 5 μl，10×下游引物P25 μl，含重组质粒的菌落1 μl、pfuDNA聚合酶1 μl加去离子水至50 μl，鉴定正确后大量培养细菌，抽提质粒行EcoR Ⅴ酶切电泳鉴定。

1.4pAd-VP3-GFP重组腺病毒质粒的构建及鉴定 PmeI酶切上述鉴定正确的pShuttle-VP3-GFP重组穿梭质粒24 h后，3 mol/L NaAc和无水乙醇沉淀DNA，漂洗离心弃上清，加入3 μl CIAP 37℃恒温水浴1 h后在50℃烤箱里去磷酸化2 h，经酚、氯仿抽提后转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183，通过TB固体培养基铺板对含有重组质粒的BJ5183进行初筛(因含有重组质粒的细菌可在含卡那霉素的培养基中生长形成克隆菌落)，挑取单克隆菌落，小量培养并提取质粒，PacI酶切电泳，若出现大于23 kb和45 kb或30 kb的特征性条带，即为阳性质粒，大量扩增并抽提阳性质粒，送上海生工公司测序。

1.5pAd-VP3-GFP重组腺病毒制备脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒并转染AD293细胞，取第一代病毒上清再转染293细胞，依上述方法再取第二代上清重复转染293细胞，收集并裂解细胞获得上清液，氯化铯密度梯度离心纯化病毒，紫外光度计检测病毒OD260和OD280值，病毒滴度=OD260×病毒稀释倍数×1.1×1012。

1.6pAd-VP3-GFP重组腺病毒在SW480细胞中的表达体外复苏并培养SW480细胞，长至75%～80%融合时，分别取MOI=0、100、200、300的病毒进行感染，倒置荧光显微镜下观察不同时间点细胞中GFP的表达情况，收集感染60 h的SW480细胞，提取总蛋白进行VP3蛋白的Western印迹检测。

2 结果

2.1VP3基因扩增及pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒的构建及鉴定以PET15b-VP3为模板行PCR扩增后电泳可见特征性402 bp VP3基因片段，回收扩增产物与线性化的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP混合，将混合后的产物转化DH5α，取转化菌液在TB琼脂糖上铺板，次日取单克隆菌落PCR扩增后电泳也可见特征性的402 bp条带。大量培养阳性克隆菌落，抽提质粒经EcoR Ⅴ酶切后电泳后可见8.9 kb和402 bp两条带，说明VP3基因已成功插入到穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP中，pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建成功。见图1。

2.2pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒构建及鉴定将酶切线性化的pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒转化超感受态大肠杆菌BJ5183并铺板，次日挑取转化菌落提取DNA，PacI酶切电泳可见大于23 kb和45 kb的片段，见图2，说明pAdeasy-1与pShuttle-VP3-hrGFP在复制起始位点与右臂之间发生了同源重组。pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒测序结果显示其VP3基因序列与GenBank的VP3 cDNA序列完全一致，见图3，说明VP3基因已成功插入到骨架质粒pAdeasy-1中，pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒构建成功。

M：DNA Marker；1：pShuttle-VP3-hrGFP经EcoR Ⅴ酶切后 (8.9 kb、402 bp)图1 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒酶切鉴定结果

M：DNA Marker；1：pAd-VP3-hrGFP经PacI酶切后(>23 kb、4.5 kb)图2 pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒酶切鉴定结果

图3 pAd-VP3-GFP重组腺病毒质粒部分测序结果

2.3pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒包装及滴度测定酶切线性化pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒，脂质体包裹后转染AD293细胞，培养1 w后可见绿色荧光蛋白(GFP)表达，见图4A，此后细胞出现病变效应，见图4B。待病变效应达到80%至90%时，收集细胞，反复冻融后离心获得病毒上清液，纯化病毒，检测OD260和OD280值分别为0.158和0.119，OD260/OD280=0.158/0.119=1.33>1.3，病毒滴度= OD260×病毒稀释倍数×1.1×1012=1.738×1012opu/ml。

图4 重组腺病毒pAd-VP3-hrGFP的包装(×100)

2.4pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒在SW480细胞中的表达将制备的重组腺病毒感染SW480细胞，60 h后可见到明显的GFP阳性细胞，阳性细胞数量随着MOI值的升高而增多，免疫印迹结果显示感染60 h后SW480细胞中可以检测到VP3蛋白表达，表达量随病毒MOI值的提高而升高，说明制备的重组腺病毒可有效感染SW480细胞并能在细胞中得到较好的表达，见图5。

1～4：MOI=300、200、100、0重组腺病毒pAd-VP3-hrGFP在SW480细胞内作用60 h后VP3蛋白的表达图5 Western印迹法检测VP3蛋白在SW480细胞中的表达

3 讨论

基因治疗是恶性肿瘤治疗的新的有效手段，安全有效的基因载体是成功进行基因治疗的关键。腺病毒既可以感染分裂期细胞，又可以感染增殖期细胞，且可在感染的细胞内获得高效表达，是当前基因治疗最常用的运载工具〔7，8〕。本文所用的腺病毒是经过改良敲除了病毒E1和E3区基因的复制缺陷性双链DNA腺病毒。这种腺病毒失去了复制和致病能力，可安全用作外源基因导入体内的载体，将其转化到含有E1或E3区基因的细胞如人胚肾AD293细胞内即可进行病毒的大量包装和复制，其优点在于〔9～11〕：基因结构简单，背景清楚，制备较容易；基因组不与宿主细胞整合，安全性好；繁殖滴度高，对静止细胞也能感染；宿主广泛，感染效率高。

本文首先通过设计5'端带有pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭质

粒EcoR Ⅴ酶切线性化末端18个碱基的上下游引物对VP3目的基因进行扩增，使得扩增的VP3目的基因产物与线性化穿梭质粒具有相同的黏性末端，二者混合在同源重组酶作用下易发生同源重组形成携带VP3基因的pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒，然后将线性化的重组穿梭质粒转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态大肠杆菌BJ5183，制备重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP，通过PCR、抗性基因初筛，酶切电泳及测序等方法对获得的产物进行鉴定以证实构建的重组腺病毒质粒准确无误。本文中两次同源重组过程均在细菌内进行，与细胞内进行比较具有明显优势，一是细菌繁殖和同源重组能力强，且对周围环境要求不严，重组效率较高。二是细菌内PCR扩增、质粒抽提、酶切等技术均较在哺乳动物细胞内操作更加简单，整个操作过程也更加简便顺利〔12〕。

本文制备的重组腺病毒可达到很高滴度，且感染率高，性质较稳定，可有效进入SW480细胞内并能稳定表达，VP3蛋白表达量与病毒感染量呈一定的量效和时效关系。

1Lanz HL，Zimmerman RM，Brouwer J，etal.Mitotic catastrophe triggered in human cancer cells by the viral protein apoptin〔J〕.Cell Death Dis，2013；7(4)：487-93.

2Los M，Panigrahi S，Rashedi I，etal.Apoptin，a tumor-selective killer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009；1793(8)：1335-42.

3刘雪梅，崔剑，侯伟健，等.TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测〔J〕.中国医科大学学报，2013；42(1)：45-8.

4王剑松，詹辉，罗群强，等.凋亡素联合不同化疗药物体外抗膀胱癌效应观察〔J〕.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2010；2(5)：216-9.

5邓守恒，柯贤柱，石小燕，等.靶向克隆法构建PEP15b-VP3原核表达载体〔J〕.成都医学院学报，2012；7(3)：393-5.

6邓守恒，陈萍.PEP-1-VP3融合蛋白的原核表达及纯化〔J〕.现代肿瘤医学，2014；22(9)：2281-4.

7王娜，朱慧明，杨俊文，等.逆转录病毒介导的凋亡素基因诱导人结肠癌细胞Lovo的凋亡〔J〕.肿瘤防治研究，2010；37(2)：146-9.

8黄庆娟，朱慧明，王娜，等.腺病毒介导的凋亡素、内皮抑素双基因对食管癌的实验研究〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2012；21(5)：423-6.

9杨月峰，李泽良，鲁茁壮，等.靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究〔J〕.中国医药生物技术，2014；9(1)：6-12.

10罗栩伟，刘康，陈竹，等.应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒〔J〕.重庆医学，2014；43(12)：1412-5.

11张文峰，邵红伟，贺华，等.腺病毒感染及胞内运输途径的研究进展〔J〕.生物工程学报，2014；30(6)：1-11.

12张又莉，徐少勇，王家宁，等.pAd-NY-ESO-1-EGFP的构建及鉴定〔J〕.郧阳医学院学报，2008；27(6)：486-9.

〔2016-06-09修回〕