顾 静 吴红彦 李海龙 杨长生 王虎平 车 敏

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

归芪聪志汤对血管性痴呆大鼠模型脑组织氧化应激损伤的影响

顾 静 吴红彦 李海龙 杨长生 王虎平 车 敏

(甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

目的观察归芪聪志汤对血管性痴呆(VD)大鼠模型脑组织氧化应激损伤的作用。方法采用反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单侧永久结扎颈总动脉法制备VD模型，从行为学、组织病理、氧化应激酶学三个方面观察归芪聪志汤对VD的影响。结果对比假手术组，模型组大鼠定位航行潜伏期明显延长，空间搜索穿越平台次数明显减少(P<0.05)，海马病理切片显示：细胞数量明显较少、细胞轮廓模糊皱缩、胞质深染、核不清晰，丙二醛(MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均明显降低；归芪聪志汤中剂量组中、高剂量组上述指标明显改变，尤以中剂量组效应最明显。对比模型组，中剂量归芪聪志汤组大鼠定位航行潜伏期明显变短，空间搜索穿越平台次数明显增多，海马病理切片显示细胞损伤减轻，MDA含量明显降低，SOD 和GSH-Px活性明显升高；中剂量归芪聪志汤疗效类似于甚至优于西药脑复康。结论中剂量归芪聪志汤通过抗氧化应激作用保护VD大鼠脑组织，改善其病理损伤和记忆功能。

血管性痴呆；氧化应激；归芪聪志汤

血管性痴呆(VD)主要是脑血管病变引起供血不足而致脑组织缺血缺氧性改变，最终使大脑功能全面衰退。近年来缺血缺氧引起的氧化应激在VD中的病理损伤作用越来越受到重视〔1～3〕，氧自由基通过氧化损伤神经元细胞膜中的不饱和脂肪酸，改变细胞膜表面Na+-K+-ATP酶活性等作用损伤神经元〔2〕。脑组织缺血缺氧性改变往往涉及并表现为脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量〔4〕、活性的改变。本研究以王清任治疗中风名方“补阳还五汤”化裁，自拟归芪聪志汤干预VD大鼠模型观察其药效和相关分子机制。

1 材料和方法

1.1实验动物、试剂 SPF级Wistar大鼠80只，体重(280±10)g，饲料由甘肃中医学院科研实验动物中心提供。SOD、MDA、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成科技有限公司；多聚甲醛等基础试剂购自天津科化。

1.2药物 归芪聪志汤药物用量参照2010年版《中华人民共和国药典》及全国高等中医院校规划教材《方剂学》确立的比例为当归∶黄芪∶川芎∶苦参∶枸杞子∶地龙∶石菖蒲=6∶3∶3∶3∶3∶2∶2，各药物用量按人与动物体表面积比换算。药剂制备：采用传统水煎法，加中药10倍量水冷浸1 h，然后加热煮沸40 min，滤出煎液，药渣再加6倍量水煮沸40 min，合并两次煎液。将药液平均分成7份，取1份量为低剂量，2份量为中剂量，4份量为高剂量。将三组药液分别水浴浓缩成252 ml，低、中、高剂量浓度为1.39、2.77、5.54 g/ml，4℃储存备用；脑复康(吡拉西坦胶囊，陕西白鹿制药股份有限公司)，脑复康药液的配制：用双蒸水配制成浓度为0.09 g/ml水溶液，4℃储存备用。

1.3VD大鼠模型制备 采用反复夹闭颈动脉加注射硝普钠降压再加单侧永久结扎颈总动脉法。大鼠术前禁食、水，用10%水合氯醛麻醉，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，模型组及药物组在夹闭双侧颈总动脉之前，腹腔注射硝普钠(2.0 mg/kg)，随即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，随后去除动脉夹通血10 min，共间歇阻断-再通双侧颈总动脉血流3次，之后结扎一侧颈总动脉，缝合伤口、保温饲养。假手术组仅分离双侧颈总动脉。术后肌注庆大霉素预防感染。

1.4动物分组及给药 大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、西药组(脑复康)、归芪聪志汤高剂量组、中剂量组、低剂量组。归芪聪志汤各组按高、中、低剂量灌胃给药，西药组给予脑复康，假手术组、模型组给予等量生理盐水，每日一次，连续灌胃治疗23 d。

1.5Morris水迷宫行为学检测 训练开始时将大鼠任意从四个象限之一面向池壁入水，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃逸潜伏期)。每次大鼠共游120 s寻找平台，若成功找到给予15 s休息时间，若未找到，将其引至平台也休息15 s，逃逸潜伏期为120 s。连续训练4 d，上午2次，下午2次。第5天撤去平台，将大鼠面向池壁放入水中找记忆平台，每只大鼠限时游60 s，记录其在60 s内游过原平台相应位置的次数。数据采集和处理由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。

1.6海马组织病理切片观察 禁食12 h颈椎脱臼处死大鼠，使头置于冰块上开颅取出脑，冰盘上剥离取出大脑皮质及海马，保存于-80℃备用。将海马放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋；海马区石蜡切片、脱蜡、复水、苏木素染色；盐酸乙醇分化、伊红复染、乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察。根据大鼠海马病理切片显示的神经细胞特点，从细胞轮廓、细胞数量、胞质深染程度、胞核清晰度等4个方面描述评价神经细胞损伤程度。每个观察指标按下述标准依次评分为1、2、3分，各指标累计评分越高表示细胞损伤越严重。细胞轮廓：1分：清楚饱满，2分：部分模糊皱缩，3分：模糊皱缩；细胞数量：1分：多，2分：较多，3分：少；胞质深染程度：1分：未深染，2分：部分深染，3分：深染；胞核清晰度：1分：清晰，分：较清晰，3分：不清晰。

1.7大鼠脑皮质匀浆液氧化应激酶学指标检测 准确称取大鼠脑皮质1 g，按1/9的比例加入9倍体积的冷生理盐水匀浆，4℃，2 500 r/min离心10 min，取上清液用冰生理盐水按1/1稀释成5%组织匀浆液。用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒，于595 nm处测OD值，绘图，运用公式计算蛋白含量。分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法、酶促反应。按试剂盒操作说明测定SOD、MDA及GSH-Px活性。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1Morris 水迷宫行为学检测结果 模型组与假手术组比较，大鼠逃逸潜伏期明显增长5.7倍(P<0.05)，与模型组比较各治疗组大鼠逃逸潜伏期均明显缩短，中剂量组缩短了71.6%(P<0.05)，与西药组比较，归芪聪志汤中剂量组大鼠逃逸潜伏期缩短最显著(P<0.05)。模型组与假手术组比较，大鼠穿越平台次数减少70%(P<0.05)，与模型组比较归芪聪志汤高剂量组、中剂量组、西药组大鼠穿越平台次数显著增多，中剂量组增加了1.9倍(P<0.05)，与西药组比较，中剂量组大鼠穿越平台次数增多最显著(P<0.05)。见表1。

2.2海马组织病理切片观察 假手术组4个观察指标海马神经细胞损伤合计为4分，模型组为12分，西药组为10分，归芪聪志汤高剂量组为8分，归芪聪志汤中剂量组为4分，归芪聪志汤低剂量组为10分。与假手术组比较，模型组海马神经细胞数量较少、细胞轮廓模糊皱缩、胞质深染、核不清晰、损伤严重；与模型组比较，各治疗组海马神经细胞损伤程度均有好转；中、高剂量归芪聪志汤对海马神经细胞损伤的改善作用优于西药组。见表2，图1。

表1 Morris水迷宫行为学检测结果

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与西药组比较：3)P<0.05，下表同

表2 各组海马组织病理切片评分(分)

圈内为细胞固缩深染主要区域图1 各组海马组织病理切片(HE，×40)

2.3脑皮质匀浆SOD、GSH-Px活性及MDA含量检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠MDA含量显著增加了1.11倍(P<0.05)。与模型组比较，西药组和归芪聪志汤高、中、低剂量组明显抑制脑皮质MDA含量，分别下降了21.8%、24.4%、37.2%和7.7%(P<0.05)。与西药组相比，归芪聪志汤中剂量组对MDA的抑制作用明显增强(19.7%，P<0.05)，归芪聪志汤高剂量组抑制效应类似于西药组，归芪聪志汤低剂量组作用较弱。与假手术组比较，模型组大鼠SOD、GSH-Px活性分别降低80.76%和80.80%(均P<0.05)。与模型组比较，西药组和归芪聪志汤组明显提高上述酶的活性：西药组SOD、GSH-Px活性分别增加了2.57倍和0.99倍；归芪聪志汤中剂量组分别提高了4.08倍和2.59倍，中剂量组归芪聪志汤组分别提高了2.83倍和1.23倍，低剂量归芪聪志汤组分别提高了81.97%和23.6%(P<0.05)。中剂量归芪聪志汤组对SOD和GSH-Px活性的增强作用优于西药组(SOD 42.2%，GSH-Px 80.6%，均P<0.05)，高剂量组效应类似于西药组，低剂量归芪聪志汤作用较弱。见表3。

表3 各组脑皮质匀浆SOD、GSH-Px活性

3 讨 论

研究认为两血管阻断法(2-VO)改良法〔5～8〕——反复阻断再灌注联合腹腔注射硝普钠法重复性、稳定性好，操作简单，对动物创伤小，存活率高，并且与VD发病机制相似，但应该注意两点，第一此方法对硝普钠注射量、环境温度要求较高，所以本次实验开始前进行了预实验，摸索硝普钠的注射条件，发现硝普钠注射量按文献2.5 mg/kg〔5〕的量过大，实验后最后确定硝普钠注射量为2.0 mg/kg时，手术时室温控制在28℃，术后24 h内控制在25℃时大鼠状态稳定，死亡数减少；第二考虑反复阻断再灌注造成短暂性脑缺血，术后大鼠可能会恢复，所以手术中反复阻断三次双侧颈总动脉后直接永久性结扎左侧颈总动脉，这样可以切断大约三分之一的脑供血，造成慢性脑供血不足状态，更接近VD发病机制。由于大脑细胞耗氧量高，抗氧化物含量较低，大脑很容易受到氧化应激损伤。脑缺血后生成大量自由基，脑内脂质过氧化作用加强，因此自由基毒性已成为脑缺血损害的关键病理因素。MDA是脂质代谢产物，可反映机体脂质过氧化的速率及强度，并间接反映组织受自由基损伤的程度，本实验表明，VD发生过程中MDA含量的改变与抗氧化酶活性密切相关，论证了氧化损伤是VD病理机制之一，提示该病治疗应从抗氧化损伤出发，从中医治法角度来看，应该积极的“益气解毒”。归芪聪志汤(黄芪、当归、地龙、石菖蒲、苦参等) 是根据中医脑病的症候特点，不局限传统活血化瘀的中风疗法，而针对浊毒损伤脑络这一关键病机，应用益气活血解毒治法。方中重用黄芪、当归为君，益气养血，活血通络；以川芎理气活血通瘀，苦参清解湿热毒火为臣；以枸杞子滋补肝肾、益精填髓，地龙活血通脑络，石菖蒲以化浊开窍醒神为佐药。诸药相合，攻补兼施，标本兼顾，使神窍得养，脑络清利。现代药理研究证明黄芪多糖具有抗衰老、抗应激、抗氧化等药理作用，可改善VD小鼠的学习记忆能力〔9，10〕；当归可抗氧自由基、抑制细胞钙超载、改善脑微循环，清除自由基，提高抗氧化酶活性，减轻膜脂质过氧化，抑制衰老模型小鼠脑组织细胞凋亡，改善其学习记忆能力〔11〕；川芎嗪扩张小血管、改善微循环等作用，抑制自由基、SOD等作用〔12〕；苦参抑制中枢神经炎症介质释放，保护神经元损伤，进而控制VD发展〔13〕。本研究证明归芪聪志汤能有效抵抗氧化应激对VD大鼠脑组织的破坏作用，从认知功能和组织病理学方面改善VD大鼠的疾病进程。

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〔2016-06-16修回〕

(编辑 曹梦园)

R749.1+3

A

1005-9202(2017)18-4443-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.006

甘肃省中药药理与毒理学重点实验室自主课题(ZDSYS-ZZKJ-2013〔B〕-004)

顾 静(1980-)，女，副教授， 博士，主要从事心血管药理生理学研究和循证中医药研究。