王胜麟 肖 武 张海峰

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉 430022)

葡多酚通过缓解内质网应激改善胰岛β细胞功能的机制

王胜麟 肖 武 张海峰1，2

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉 430022)

目的探讨葡多酚对胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的影响及机制。方法从克伦生葡萄提取葡多酚后干预高脂(HDF)喂养小鼠和胰岛β细胞株Min-6，检测内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白(GRP)-78、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、长链非编码RNA(lncRNA)GAS5及microRNA(miR)-346表达。通过小分子RNA干扰(siRNA)下调lncRNA GAS5后验证lncRNA GAS5在葡多酚调节内质网应激和miR-346表达水平中的作用。结果葡多酚可降低HDF动物血糖并改善胰岛素抵抗；同时抑制HDF导致小鼠胰腺内质网标志物GRP-78及CHOP升高。葡多酚还上调lncRNA GAS5和下调miR-346。siRNA-lncRNA GAS5可抑制葡多酚介导的GRP-78和miR-346下调。结论葡萄酚通过抑制内质网应激改善胰岛素抵抗和胰岛β细胞，其抑制内质网应激是通过上调lncRNA GAS5继而下调miR-346实现的。

葡多酚；内质网应激；胰岛素抵抗；长链非编码RNA GAS5；microRNA-346

胰岛β细胞功能障碍是糖尿病，特别是糖尿病后期胰岛β细胞衰竭的最重要原因。在2型糖尿病(T2DM)发生过程中，早期由于机体对胰岛素不敏感，导致脂肪动员增加，血清游离脂肪酸(FFA)增加，对胰岛细胞产生脂毒性，成为胰岛β细胞功能障碍的重要始动因素；而继发于脂肪酸及其衍生物的β细胞内质网应激(ERS)〔1，2〕则是导致胰岛β细胞障碍的持续机制，是胰岛素抵抗(IR)和糖尿病发病的中枢环节。植物多酚是一类主要存在于植物皮、叶和果中的成分复杂的可溶性酚类化合物，多种植物来源的多酚化合物均具有抗氧化、抗炎等作用，部分还具有抗血小板聚集及抑制微生物作用。其中，葡多酚(又名葡萄原花青素，GPC)的作用近年备受关注。近年研究结果显示，多元酚通过抑制ERS和减少β细胞凋亡改善糖尿病患者β细胞功能，并鉴定出一系列微小RNA(microRNA)和信号通路激酶〔3〕。长链非编码RNA(lncRNA)近年来被证实广泛参与细胞代谢，但lncRNA在GPC抑制ERS和改善β细胞功能中的作用尚无报道。本研究旨在探讨lncRNA在GPC介导的胰岛β细胞保护和改善ERS中的作用。

1 材料与方法

1.1动物和细胞 SPF级10周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重30～40 g，购于广东省医学实验动物中心，分为对照组(NC组，普通饲料喂养)，高脂饲料组(HDF组，高脂饮料喂养)；高脂饲料+GPC酚组(HDF+GPC组，250 mg/kg，见下述)。小鼠胰岛β细胞株Min-6购自美国ATCC，使用低糖DMEM培养基，10%胎牛清，1%青、链霉素于37℃培养箱以5%CO2培养。使用化学合成siRNA(5′-CUUGCCUGGACCAGCUUAAdTdT-3′，锐博，广州，中国)，以Lipo RNAiMAX(Thermo Fisher，San Diego，USA)转染Min-6抑制细胞内lncRNA GAS5表达。

1.2高脂饲料和棕榈酸 高脂饲料(D12492，60%热量来源于脂肪)购自广东省医学实验动物中心，棕榈酸(PA)购于Sigma；PA溶于10% FFA BSA。

1.3GPC萃取、纯化和鉴定 GPC根据文献方法〔4〕制备。取无核克伦生葡萄，晒干并碾碎至粉用萃取法获得，以GPC标准品(岛田株式会社，大阪，日本)为参照，高效液相色谱法测定纯度，GPC含量大于99%。

1.4空腹血糖(FPG)、血胰岛素(Ins)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) 干预结束后，分别取小鼠禁食10 h及2 g/kg葡萄糖灌胃后，眼球静脉取血，使用氧电极法于全自动生化仪测定FPG；使用免疫酶联吸附反应方法测定Ins含量；使用HOMA稳态模型计算HOMA-IR〔FPG(mmol/L)×Ins(mIU/L)÷22.5〕。

1.5逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR) 取干预结束后动物胰腺或细胞，冰PBS洗涤后置于液氮中碾磨至粉，使用TRIZOL-氯仿法抽提总RNA，商业化逆转录试剂盒(宝生物工程有限公司，大连)进行反转录后使用SYBR法(宝生物工程有限公司，大连)进行荧光定量。RT-qPCR使用引物：GRP-78正义：5′-CACTATTGCTGGACTGAATG-3′；反义：5′-CCTTGCTTGATGCTGAGA-3′；CHOP正义：5′-GAGGAGGAAGAGCAAGGA-3′；反义：5′-GAGACAGACAGGAGGTGAT-3′；lncRNA GAS5正义：5′-AAGCCATTGGCACACAGGCATTAG-3′；反义：5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；miR-346正义：5′-CTGTGTTGGGCG-TCTGTCTG-3′；反义：5′-GAAGGAGCAGCTCTGCCCAG-3′；β-Tubulin正义：5′-GAACACAGACGAGACCTAC-3′；反义：5′-TCCACCTCCTTCATAGACAT-3′。

1.6Western印迹 按上述方法碾磨至粉后加入细胞裂解液(天根生化科技有限公司，北京)，使用超声破碎细胞仪匀浆后离心、收集并以BCA法(天根生化科技有限公司，北京)定量上清总蛋白含量。加入上样缓冲液后进行SDS-PAGE分离，经转膜、一抗和二抗孵育，加入ECL发光液(Millipore，Massachusetts，USA)后于凝胶成像系统捕获图像。

2 结 果

2.1GPC对HDF喂养小鼠FPG及胰岛素抵抗(IR)的影响 HDF组空腹及葡萄糖负荷后血糖均高于NC组；基础胰岛素(B-Ins)水平高于NC组，但葡萄糖负荷后胰岛素(S-Ins)水平低于NC组；HOMA-IR显著高于NC组。与HDF组相比，GPC组空腹及血糖葡萄糖负荷后血糖均低于HDF组，B-Ins水平亦低于NC组而葡萄糖负荷后胰岛素水平与HDF组相近；HOMA-IR低于HDF组，但仍高于NC组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组血糖、Ins及HOMA-IR比较

与NC组比较：1)P<0.05；与HDF组比较：2)P<0.05

2.2GPC对HDF喂养小鼠胰腺组织ERS标志物的影响及可能机制 见图1，图2。与NC组相比，HDF组胰腺分子伴侣葡萄糖调节蛋白(GRP)-78及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达均增高，而GPC可削弱此二者改变(NC组 vs HDF组 vs GPC组：0.13±0.02 vs 0.43±0.04 vs 0.26±0.03)。与NC组(1.0±0.02)相比，HDF组胰腺miR-346表达显著升高(2.37±0.2)，lncRNA GAS5显著降低(0.37±0.05)；与HDF组相比，GPC组胰腺lncRNA GAS5表达升高(HDF组0.37±0.05，GPC组0.75±0.09)，miR-346表达降低(HDF组2.37±0.20，GPC组1.68±0.30)。

图1 CPC对各组胰腺ERS标志物GRP-78、GHOP表达的影响

图2 GPC对PA刺激的Min-6表达GRP-78、CHOP的影响

2.3lncRNA GAS5在GPC改善ERS影响中的作用 以PA刺激Min-6细胞，检测GRP-78及CHOP水平(NC组vs NDF组vs GPC组：0.7±0.07 vs 1.3±0.15 vs 0.79±0.08)以及lncRNA GAS5表达水平(HDF组vs GPC组：1.0±0.01 vs 0.46±0.05 vs 0.89±0.9)和miR-346表达(NC组vs HDF组vs GPC组：1.0±0.02 vs 3.95±0.02 vs 2.67±0.3)。与si-scramble相比，siRNA-GAS5可削弱GPC对GRP-78的抑制作用(HDF组vs GPC组：0.16±0.02 vs 0.49±0.09，P=0.01)(图3)，同时miR-346表达上调(HDF组vs GPC组：1.0±0.04 vs 1.79±0.09，P<0.01)。这就说明，上调lncRNA GAS5是GPC拮抗ERC和抑制miR-346的重要途径。

图3 siRNA-GAS5对GRP-78表达的影响

3 讨 论

胰岛β细胞功能受损是糖尿病发病和持续的核心事件，贯穿了糖尿病发生发展的全过程，而由于IR造成的血清脂肪酸致β细胞脂毒性是胰岛β细胞受损的关键原因。脂毒性导致胰岛β细胞功能障碍机制复杂，ERC在其中的作用是近年研究热点。本研究通过体内外实验证实GPC具有改善IR、抑制胰岛β细胞ERC的作用；机制实验进一步证实这种作用，起码部分由lncRNA GAS5介导。GAS5是早年被报道的非编码RNA，但其作用机制和功能直到近年才被逐步发现。GAS5早期作为一种细胞抑制增殖因子被认识，在多种肿瘤细胞中表现出强大的抑制作用〔5，6〕。本研究结果显示GPC改善IR同时上调lncRNA GAS5，这可能不能从GAS5经典作用得到解释。本研究结果显示，miR-346与GAS5呈反向表达模式，而前者是ERS的强力促进因素〔7〕。因此，GAS5可能通过非直接作用模式调节ERS和改善IR，而是通过对miR-346抑制实现缓解ERC，从而改善IR。同样必须注意的是，GPC干预后，lncRNA GAS5升高倍数低，仅不足2倍。因GAS5在细胞内本身丰度较高，这提示可能在这样的丰度下即可实现对miR-346抑制，而更高的表达丰度可能出现RNA-蛋白质相互作用等，进而发挥抑制胰岛素信号通路和细胞生存受损的相反结果。此外，亦有研究显示GAS5可作为糖皮质激素受体拟似物，竞争结合糖皮质激素，从而抑制糖皮质激素的生物学效应〔8〕，而后者对IR的促进作用已得到广泛证实。同时，GAS5也可能作为小核仁RNA调节rRNA及核糖体生成调节生命活动〔9〕，但这种机制在改善ERS和IR中是否发挥作用尚不清楚。

GPC的实质是一类具有多元酚结构的可溶性混合物总称，主要包含了单宁类、黄酮类、酚酸类及花色苷类物质。这种多元酚虽然构成复杂，但因为具有共同的多元酚化学结构，因此有共同作用机制被提出。早年认为，多元酚因具有疏水键和多点氢键，能够与蛋白质结合从而调节蛋白质功能；还因酚羟基结构的邻位酚羟基易被氧化而作为氧化底物中和活性氧以发挥抗氧化作用〔10〕。确实，支持本研究结论的是，玫瑰多酚等亦被证实促进AMPK磷酸化〔3〕，而后者是改善IR重要功能蛋白。GPC调控GAS5作用机制未知，但已有多元酚通过表观遗传学修饰调节非编码RNA报道〔11〕，而甲基化等表观遗传修饰又在GAS5表达中发挥重要作用〔12〕。但GPC是否通过改变GAS5启动子区域DNA甲基化发挥作用仍需要研究进一步证实。

1Clark AL，Urano F.Endoplasmic reticulum stress in beta cells and autoimmune diabetes〔J〕.Curr Opin Immunol，2016；43：60-6.

2Hasnain SZ，Prins JB，McGuckin MA.Oxidative and endoplasmic reticulum stress in β-cell dysfunction in diabetes〔J〕.J Mol Endocrinol，2016；56(2)：R33-54.

3Joven J，Espinel E，Rull A，etal.Plant-derived polyphenols regulate expression of miRNA paralogs miR-103/107 and miR-122 and prevent diet-induced fatty liver disease in hyperlipidemic mice〔J〕.Biochim Biophys Acta,2012;1820(7)：894-9.

4Li JH，Liu S，Zhou H，etal.Starbase v2.0：decoding miRNA-ceRNA，miRNA-ncRNA and protein-RNA interaction networks from large-scale CLIP-Seq data〔J〕.Nucleic Acids Res,2014;42：92-7.

5Xue Y，Ni T，Jiang Y，etal.LncRNA GAS5 inhibits tumorigenesis and enhances radiosensitivity by suppressing mir-135b expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Oncol Res,2017:epub.

6Xue D，Zhou C，Lu H，etal.LncRNA GAS5 inhibits proliferation and progression of prostate cancer by targeting miR-103 through AKT/mTOR signaling pathway〔J〕.Tumour Biol,2016;37(12):16187-97.

7Bartoszewski R，Brewer JW，Rab A，etal.The unfolded protein response (UPR)-activated transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP1) induces microRNA-346 expression that targets the human antigen peptide transporter 1 (TAP1) mRNA and governs immune regulatory genes〔J〕.J Biol Chem,2011;286(48)：41862-70.

8Xu C，Zhang Y，Wang Q，etal.Long non-coding RNA GAS5 controls human embryonic stem cell self-renewal by maintaining NODAL signalling〔J〕.Nat Commun,2016;7：13287.

9He X，Chen X，Zhang X，etal.An Lnc RNA (GAS5)/SnoRNA-derived piRNA induces activation of TRAIL gene by site-specifically recruiting MLL/COMPASS-like complexes〔J〕.Nucleic Acids Res,2015;43(7)：3712-25.

10Sureda A，Tejada S，Bibiloni MM，etal.Polyphenols：well beyond the antioxidant capacity：polyphenol supplementation and exercise-induced oxidative stress and inflammation〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2014;15(4)：373-9.

11Oliveras-Ferraros C，Fernández-Arroyo S，Vazquez-Martin A，etal.Crude phenolic extracts from extra virgin olive oil circumvent de novo breast cancer resistance to HER1/HER2-targeting drugs by inducing GADD45-sensed cellular stress，G2/M arrest and hyperacetylation of Histone H3〔J〕.Int J Oncol,2011;38(6)：1533-47.

12Zhang N，Wang AY，Wang XK，etal.GAS5 is downregulated in gastric cancer cells by promoter hypermethylation and regulates adriamycin sensitivity〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016;20(15)：3199-205.

〔2017-04-17修回〕

(编辑 徐 杰)

Grapeprocyanidinsameliorateinsulinresistanceandimproveβ-cellfunctionviaattenuationofendoplasmicreticulumstressWANGSheng-Lin,XIAOWu,ZHANGHai-Feng.

DepartmentofPharmacy,No.1HospitalofWuhan,Hubei430022,Wuhan,China

ObjectiveTo explore the effects of grape procyanidins (GPC) on insulin resistance (IR) and β-cell function.MethodsGPC was extracted from plants (crimson grape), which was administrated to HDF diet induced IR in mice. GRP-78 and CHOP were detected to reflect magnitude of endoplasmic reticulum stress (ERS). Long non-coding RNA GAS5 (lncRNA GAS5) and microRNA-346 (miR-346) were also measured. Small interference RNA (siRNA) against lncRNA GAS5 was used to verify the increased levels of lncRNA GAS5 and to explore its role in GRP-78 and miR-346 regulations by GPC.ResultsGPC lowered blood glucose and released IR, which was accompanied by lower levels of ERS markers of GRP-78 and CHOP. Expression of lncRNA GAS5 was up-regulated while miR-346 was down-regulated by GPC. siRNA-lncRNA GAS5 reversed the GRP-78 and miR-346 down-regulations by GPC.ConclusionsGPC could ameliorate IR through attenuation of ERS, which is mediated by up-regulation of lncRNA GAS5 and subsequently inhibition of miR-346.

Grape procyanidins; Endoplasmic reticulum stress; Insulin resistance; Long non-coding RNA GAS5, microRNA-346

R587

A

1005-9202(2017)18-4432-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.002

国家自然科学基金项目(81300071)；广东省自然科学基金项目(2014A030313049)；广东省医学科研基金项目(A2014229，A2015019，A2016270)；广州市科技计划项目(201510010048，201510010050)

1 中山大学孙逸仙纪念医院 2 广东省心电生理与心律失常实验室

张海峰(1982-)，男，博士，主治医师，主要从事脂肪酸代谢及脂毒性研究。

王胜麟(1967-)，男，药剂师，主要从事药学研究。