张 涛 刘 磊 姜旭勉

(武汉市中心医院胃肠外科,湖北 武汉 430000)

结直肠癌患者膳食纤维摄入情况对肠道菌群的影响

张 涛 刘 磊 姜旭勉

(武汉市中心医院胃肠外科,湖北 武汉 430000)

目的 探讨结直肠癌患者膳食纤维的摄入对肠道菌群的影响。方法 280例结直肠癌患者为研究对象，并选取参与体检的290例健康人群作为对照组；采用自行设计的调查问卷调查受试者基本情况及膳食纤维摄入情况。收集两组研究对象粪便，提取粪便DNA，采用荧光定量PCR方法测定受试者肠道菌群水平，分析肠道菌群与大肠癌发病的相关性。结果 除谷类与海鲜，结直肠癌组蔬菜、水果、豆类的摄入均明显低于对照组(均P<0.05)，肉类的摄入明显高于对照组(P<0.05)，总膳食纤维的摄入明显低于对照组研究对象(P<0.05)。结直肠癌患者乳酸杆菌、双歧杆菌明显减少(P<0.05)，大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、拟杆菌属、脆弱拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌、吉氏拟杆菌、普通拟杆菌、梭杆菌属、梭菌属、肉毒梭菌、艰难梭菌明显增多(均P<0.05)。在结直肠癌组中，除脆弱拟杆菌、单形拟杆菌外，在对照组中，除吉氏拟杆菌外高膳食纤维亚组与低膳食纤维亚组的各菌群水平均有差异(均P<0.05)；在高膳食纤维亚组，结直肠癌患者与对照组研究对象各菌群水平均有差异(均P<0.05)。结直肠癌组与对照组乳酸杆菌、双歧杆菌与膳食纤维水平呈正相关(均P<0.05)，粪肠球菌、屎肠球菌、普通拟杆菌、梭杆菌属、梭菌属、肉毒梭菌、艰难梭菌与膳食纤维水平呈负相关(均P<0.05)。结论 结直肠癌患者膳食纤维的摄入情况影响肠道菌群水平。

结直肠癌；膳食纤维；肠道菌群

结直肠癌是下消化道常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均较高〔1〕。肠道菌群对结直肠癌发生和发展的研究发现肠道菌群失衡在结直肠癌的发生和发展中可能发挥重要作用，研究表明，膳食纤维是结直肠癌的保护性因素〔2，3〕。但关于膳食纤维的摄入与肠道菌群的相互作用及对结直肠癌发生和发展影响的研究还未报道。因此，本研究拟探讨结直肠癌患者膳食纤维的摄入与肠道菌群的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 结直肠癌组 选取2015年1月至2016年6月280例结直肠癌患者为研究对象。纳入标准：新发患者；符合结直肠癌诊断标准，并经电子结肠镜及病理诊断确诊；无结直肠癌家族史，无结直肠手术史；身体状况良好，不合并心、肝、肾、血液系统疾病；无精神神经疾病及认知障碍，意识清楚，能够完成问卷调查；近3个月内未使用抗生素，未饮用酸奶等微生态制剂；知情并同意本次调查。排除标准：未确诊患者；有慢性腹泻、炎性肠病、结肠息肉等胃肠相关疾病的患者；合并心、肝、肾、血液系统疾病者；有胃肠手术史者；合并精神神经疾病，无法完成问卷调查者；拒绝签署知情同意书者。

1.1.2 对照组 选取同期在体检科进行体检的290例健康体检者。纳入标准：无肠道疾病症状及消化道慢性疾病史者，常规体检及粪便常规检查均无异常；无结肠癌家族史；近3个月内未使用抗生素、酸奶等微生态制剂使用史；无精神神经疾病及认知障碍，意识清楚，能够完成问卷调查知情并同意本次调查。排除标准：患有慢性腹泻等慢性肠道疾病，及结肠息肉、结肠溃疡等疾病者；有胃肠道手术史者；有交流障碍，无法完成问卷调查者；拒绝参与本项研究者。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查 根据文献〔4〕自行编制调查问卷。问卷内容包括研究对象一般情况、健康相关因素及半定量食物频率表，研究对象一般情况包括年龄、性别、身高、体重等资料；健康相关因素包括生活习惯等；半定量食物频率包括谷类、豆及豆制品类、蔬菜类、水果类、坚果类、肉类、奶及奶制品类、蛋类、海产品类等10类食品121种食物的摄入频率及每次摄入量。膳食纤维摄入量通过中国食物成分表2004计算得到。

在本次调查前，研究员经过统一培训，能够解答研究对象调查过程中出现的各种问题；采取面对面访谈的形式，调查完成后问卷当场回收，并复核问卷，及时发现调查过程中出现的遗漏项，并及时改正。

1.2.2 粪便菌群数量测定 粪便样本的采集：收集所有受试者新鲜大便，用天平称取终端大便3 g。存放于无菌离心管中，-80℃冰箱保存备用。

实验仪器：超净工作台(苏州净化设备公司)，9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)，核酸蛋白检测仪、电泳仪Power PAC 3000、凝胶成像分析系统Gel Doc 2000TM(美国BIO- RAD公司)，荧光定量PCR仪ABI 7300(美国ABI公司)，低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，荧光定量PCR仪Light Cycler 2.0(瑞士罗氏公司)。实验试剂：DNA提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、RNA 酶抑制剂、Oligo dT18、dNTPs(中国天根公司)，Power SYBR® Green PCR Master Mix(美国ABI公司)，DNA分子标准Marker(加拿大Fermentas公司)，琼脂糖(美国 Introvergen公司)，MMLV逆转录酶(美国Promega 公司)。其他试剂：DEPC水、乙醇、氯仿、异丙醇、氯仿- 异戊醇(24∶1)均为国产分析纯。

引物的设计与合成：参照文献〔5〕设计大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、拟杆菌属等引物，由上海生工生物技术服务公司合成。

粪便DNA的提取：粪便样本预处理：取0.5 g粪便样本，加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中充分混匀，并于超低温离心机中离心3 min，取上清，重复离心操作3次，再取上述上清液加入EP管中，超低温离心机中12 000 r/min离心10 min，收集沉淀。粪便DNA的提取及纯化：按照试剂盒说明提取DNA，粗提取完毕后，采用DNA纯化试剂盒纯化DNA，然后于核酸蛋白检测仪检测DNA浓度及A260/A280纯度。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA片段大小及完整性，并于凝胶成像分析系统观察。

实时荧光PCR反应：Real- time PCR Master Mix(2×)10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA模板(300 ng)2 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)补足至20 μl。将反应体系瞬时离心，上机循环。PCR循环参数：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火10 s，68℃延伸40个循环，74℃延伸30 s。每次试验均设标准品与阴性对照，试验完成后采用Light Cycler PCR仪分析粪便标本所含细菌拷贝数的Ct值，并与标准曲线比较，求得粪便样本菌群的定量结果。

2 结 果

2.1 研究对象一般情况及膳食纤维摄入情况 本次调查共收集结直肠癌患者280例，在数据收集过程中，因数据不完整、信息错误、有结直肠癌家族史等原因剔除34例，最后246例患者进入统计分析。对照组290例，其中因数据不全、信息错误等原因剔除32例，最后258例纳入研究。

两组研究对象年龄、性别构成、体力活动、体重指数(BMI)、吸烟、饮酒等差异均无统计学意义(均P>0.05)。除谷类与海鲜，结直肠癌组蔬菜、水果、豆类的摄入均明显低于对照组(均P<0.05)，肉类的摄入明显高于对照组(P<0.05)，总膳食纤维的摄入明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般情况及膳食纤维摄入比较

2.2 研究对象菌群水平比较 结直肠癌患者乳酸杆菌、双歧杆菌明显减少(P<0.05)；大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、拟杆菌属、脆弱拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌、吉氏拟杆菌、普通拟杆菌、梭杆菌属、梭菌属、肉毒梭菌、艰难梭菌明显增多(均P<0.05)。见表2。

2.3 研究对象不同水平膳食纤维摄入者肠道菌群水平分析 将膳食纤维摄入水平按照摄入量的中位数分为两组，低于P50为低膳食纤维，高于P50为高膳食纤维，将膳食纤维分层后比较两组肠道菌群水平。在结直肠癌组中，除脆弱拟杆菌、单形拟杆菌外，在对照组中，除吉氏拟杆菌外，高膳食纤维亚组与低膳食纤维亚组的各菌群水平均有差异(均P<0.05)；在高膳食纤维亚组，结直肠癌患者与对照组研究对象各菌群水平均有差异(均P<0.05)。见表3。

2.4 肠道菌群与膳食纤维的相关性分析 结直肠癌组与对照组乳酸杆菌、双歧杆菌与膳食纤维水平呈显著正相关(均P<0.05)；粪肠球菌、屎肠球菌、普通拟杆菌、梭杆菌属、梭菌属、肉毒梭菌、艰难梭菌与膳食纤维水平呈显著负相关(均P<0.05)。见表4。

表2 研究对象菌群水平比较

与对照组比较：1)P<0.05

表3 不同水平膳食纤维肠道菌群水平分析

与结直肠癌组低膳食水平组相比：1)P<0.05；与对照组高膳食纤维水平相比：2)P<0.05；与对照组低膳食纤维水平相比：3)P<0.05

表4 肠道菌群与膳食纤维的相关性分析

3 讨 论

肠道菌群失衡对肠道的致癌作用可能通过肠道菌群失衡导致肠道黏膜受损、引发肠道黏膜的慢性炎性反应、肠道菌群产生多种生物酶及毒性代谢产物活化致癌物等方式〔6〕。结直肠癌患者肠道菌群水平与健康人群存在差异，这与文献研究一致〔7〕。双歧杆菌、乳酸杆菌等肠道有益菌能够与肠道黏膜结合形成生物学屏障，保护肠道不受生物、化学因素的侵袭，达到防癌作用。肠球菌、肠杆菌等在正常情况下通过释放毒素相互制约，并能达到一种平衡状态，当菌群失调时，可破坏肠道的微生态，使肠道黏膜的屏障功能减弱，从而促进癌症的发生；粪肠球菌可在肠道产生大量自由基、过氧化物等有害物质损伤肠道DNA，引起肿瘤发生。目前对于膳食纤维抗癌及机制的研究较多且复杂〔8～11〕，本研究发现，膳食纤维对肠道菌群具有一定的调节作用。综合肠道菌群与结直肠癌的关系，提示膳食纤维可能通过提高肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的水平，降低肠道中大肠杆菌、肠球菌等有害菌的水平，影响肠道菌群在结肠癌发病过程中的作用。但本研究并未将膳食纤维摄入情况与肠道菌群构成及结直肠癌的进展进一步研究。因此，今后研究应加大样本量，进一步探索纤维摄入情况与肠道菌群构成及结直肠癌进展的关系。

1 Siegel R,Desantis C,Jemal A.Colorectal cancer statistics,2014〔J〕.CA Cancer J Clin,2014;64(2):104- 17.

2 秦雪玲.结直肠癌膳食及相关危险因素的病例对照研究〔D〕.青岛:青岛大学,2012.

3 孙小莉,曹晓侠,丁晓明,等.宝鸡地区80例结直肠癌患者发病危险因素研究〔J〕.现代生物医学进展,2016;16(23):4505- 8.

4 乌日丽其,宋 华,李左军,等.结直肠癌患病饮食相关危险因素病例对照研究〔J〕.疾病监测与控制,2016;10(1):70- 2.

5 郭世奎.实时荧光定量PcR技术对结直肠癌患者肠道微生态的研究〔D〕.昆明:昆明医学院,2011.

6 帅 群.肠道菌群失衡和结直肠癌关系的研究进展〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2016；23(3):427- 31.

7 王婷婷.肠道菌群结构变化与结直肠癌发生发展关系的研究〔D〕.上海:上海交通大学,2012.

8 罗非君,聂 莹.膳食纤维抗癌作用及其分子机理的研究进展〔J〕.食品与生物技术学报,2015;34(12):1233- 5，8.

9 Lahmann PH，Ibiebele TI，Webb PM，etal.A case- control study of glycemic index，glycemic load and dietary fiber intake and risk of adenocarcinomas and squamous cell carcinomas of the esophagus：the Australian Cancer Study〔J〕.BMC Cancer,2014;14(1):877.

10 Zhang Z，Xu G，Ma M，etal.Dietary fiber intake reduces risk for gastric cancer：a meta- analysis〔J〕.Gastroenterology,2013;145(1):113- 20.

11 Deschasaux M，Pouchieu C，His M，etal.Dietary total and insoluble fiber intakes are inversely associated with prostate cancer risk〔J〕.J Nutr,2014；144(4):504- 14.

〔2017- 04- 21修回〕

(编辑 袁左鸣)

张 涛(1974- )，男，硕士，副主任医师，主要从事胃肠外科方面的研究 。

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A

1005- 9202(2017)15- 3853- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.096