赵珍东 夏 黎 张现涛 方春生 马建荣 汪小根

(广东食品药品职业学院中药学院，广东 广州 510520)

银杏叶内酯N对PC12细胞凋亡的保护作用

赵珍东 夏 黎 张现涛1方春生 马建荣 汪小根

(广东食品药品职业学院中药学院，广东 广州 510520)

目的 探讨银杏内酯N对过氧化氢(H2O2)诱导的PC12 细胞凋亡的保护作用。方法 用H2O2诱导PC12细胞损伤，刺激其凋亡，给予不同剂量的受试药物干预。用MTT法检测细胞存活率；用吖啶橙染色检测银杏内酯N对PC12细胞凋亡的作用；用流式细胞术检测银杏内酯N对PC12细胞活性氧(ROS)的影响，荧光定量RT- PCR法、Western印迹法分别检测Bcl- 2、Bax mRNA和相应蛋白的表达。结果 银杏内酯N可对抗H2O2诱导的PC12损伤，提高存活率和抑制凋亡，降低PC12细胞ROS水平，与模型组比较均有显著差异(P<0.05)；Bcl- 2 蛋白及mRNA 表达量升高，而Bax mRNA和Bax蛋白及表达量降低，与模型组比较均有显著差异(P<0.05)，且呈一定的量效关系。结论 银杏内酯N可对抗H2O2的神经毒性，其机制与调节凋亡相关基因及蛋白的表达有关。

银杏内酯N；PC12细胞；过氧化氢；凋亡

银杏叶提取物具有神经保护、改善认知功能，扩张血管，改善微循环，抗血小活化因子，抗氧化，抗细胞凋亡等作用，能保护脑缺血损伤，对老年性痴呆具有防治作用〔1～4〕，其活性成分主要有黄酮类、萜内酯类等，其中萜内酯类——银杏内酯是银杏叶提取物中的主要活性成分之一。银杏总内酯中目前研究较多的是银杏内酯B(GB)，具有抗神经损伤、抗脑缺血等作用。本课题组从银杏粗提物中分离得到新化合物银杏内酯N(GN)，结构类似GB，水溶性优于GB，其药理活性可能比GB更强〔5，6〕。为了探讨GN对神经细胞凋亡的保护作用，本研究拟以大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)为研究对象，用过氧化氢(H2O2)诱导PC12 细胞凋亡，用吖啶橙染色观察药物抗细胞凋亡作用，流式细胞仪测定 PC12 细胞内活性氧(ROS)浓度，荧光定量RT- PCR法及Western印迹法检测凋亡相关基因及蛋白的表达，以探讨其抗凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试药试剂与仪器 GN(自制，纯度为97%〔7〕)、GB(四川维克奇生物科技公司，批号：20140610)，用二甲基亚砜配制成10 mmol/L的贮存液，均置于-20℃保存。实验前用1640完全培养基稀释至所需不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、吖啶橙染色试剂盒，购自北京斯百汇生物科技有限责任公司；ROS检测试剂盒(DCFH- DA，2′，7′- 二氯荧光黄双乙酸盐)，购自上海碧云天生物技术研究所；荧光定量RT- PCR检测试剂盒，购自TAKARA公司；Bcl- 2、Bax 和β- actin 抗体，购自Bioworld 公司；胎牛血清、马血清购自杭州四季青公司；1640培养基，购自Gibco公司；其他试剂均为分析纯。多功能酶标仪(MK3型)、高速台式冷冻离心机(CT14RD)、超净工作台(MSC1.2)、CO2培养箱(Model 311)，美国Thermo Forma公司；倒置相差显微镜、荧光显微镜，德国莱卡公司；流式细胞仪(Epics- XL)，美国Beckman公司；荧光定量PCR仪LightCycler®480 Ⅱ，Roche公司；垂直凝胶电泳、电转系统，美国Bio- Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12 细胞株，半分化，引自中山大学实验动物中心。细胞复苏后，加入含10%的马血清，5%的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃，5%CO2及饱和湿度下培养。传3～4代待细胞生长稳定后开始实验。

1.2.2 实验分组 将传3～4代 PC12 细胞以104/孔接种于96孔培养板，细胞贴壁过夜。实验分为6组：正常组(完全培养基中正常培养，24 h后换培养液培养)、模型组(细胞培养24 h后与0.2 mmol/L H2O2共培养24 h)、GN低、中、高剂量处理组(细胞正常培养24 h后分别加入终浓度为2、4、8 μmol/L的 GN 2 h后，加入0.2 mmol/L H2O2作用24 h，GB终浓度为10 μmol/L)。

1.2.3 细胞存活率检测 将PC12细胞悬液接种于96孔培养板中，每组设5个复孔，并设空白孔(不加细胞和药物)。24 h后，正常组加入100 μl新完全培养基，模型组加入含有H2O2的RPMI1640培养基，GN低、中、高剂量组在H2O2加入前2 h分别加入相应浓度的GN或GB，继续培养24 h。实验结束后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续孵育4 h，去上清加入DMSO 150 μl/孔，水平摇床振荡，酶标仪490 nm波长读取各孔吸光度值，读取OD值。根据公式：细胞存活率=(实验组OD值-空白对照OD值)/(对照组OD-空白对照组OD值)×100%。

1.2.4 形态学观察 将PC12细胞按4×105个接种于12孔板，培养24 h后，按实验分组干预后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.2.5 吖啶橙染色 将PC12细胞按4×105个接种于12孔板，培养24 h后，按实验分组给以不同处理后，每孔加入10 μl 吖啶橙染色液(30 mg/L)，避光染5 min，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 细胞内ROS检测 将PC12细胞约8×105个接种于6孔培养板，处理同前，培养12 h后，胰酶消化，离心收集细胞，加入新鲜配制含有DCFH- DA(1∶1 000)的无血清培养基中，混匀后37℃避光孵育30 min，5 min间隔颠倒混匀，无血清培养基洗涤，上流式细胞仪检测。

1.2.7 荧光定量PCR法检查Bcl- 2、Bax mRNA的表达 实验结束后，收集各组细胞，按照Trizol一步法抽取细胞总RNA，定量后取2 μg总RNA逆转录成cDNA，反转录反应条件：37℃15 min，85℃ 5 s。以β- actin为内参照，上下游引物由生工生物工程(上海)公司合成。Bcl- 2 上游引物：5′- CCTTGTCAGCACTTGGAATG- 3′；下游引物：5′- CTTCATTCTTCAACTTGGGCG- 3′；Bax上游引物：5′- TGCTACAGGGTTTCATCCAGG- 3′；下游引物：5′- TCTGCCGTTGAAGTTACCCAG- 3′；β- actin上游引物：5′- AGAGGGAAATCGTGCGTGAC- 3′；下游引物：5′- TGGCACTTTTCTACTGGGTC- 3′。荧光定量PCR 扩增：扩增反应条件如下，预变性：95℃ 30 s；40个循环(95℃ 5 s，60℃ 30 s)；解离：95 ℃ 15 s，60℃ 60 s；溶解曲线：65℃ 30 s。温度设置：起始温度为65℃，结束温度设为95℃，温度变化设为0.5℃，重复次数61。荧光定量PCR反应结束后，采用ΔΔCt法对结果进行统计分析。其中ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，基因相对表达量=2-ΔΔCt。

1.2.8 Western印迹检测Bcl- 2、Bax蛋白表达的变化 实验结束后，冰浴裂解细胞，高速4℃离心20 min，收集上清。经Bio- Rad 法进行蛋白定量后，电泳，转膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃一抗(1∶1 000)过夜。PBST洗膜3次，每次10 min。加二抗稀释液(1∶5 000)孵育2 h，PBST 洗涤3次，每次10 min。加入ECL试剂，曝光，显影，定影，扫描拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 GN对H2O2诱导PC12细胞损伤存活率的影响 根据预实验的结果，选取0.2 mmol/L的H2O2浓度作为损伤浓度。0.2 mmol/L H2O2作用于PC12细胞24 h后，模型组细胞损伤明显，存活率下降〔(52.07±2.72)%〕，与正常组相比差异显著〔(99.91±1.0)%,P<0.01〕。给予低、中、高剂量GN干预后，细胞存活率明显上升〔(62.86±1.95)%、(73.45±4.75)%、(80.16±3.19)%〕，与模型组有显著差异(P<0.05或P<0.01)。这表明GN能抑制H2O2导致的细胞损伤，GN在2～8 μmol/L剂量范围内，其保护作用呈量效关系，活性比GB〔(78.56±2.48)%〕强。

2.2 GN对H2O2诱导的PC12细胞损伤形态的影响 倒置显微镜下观察，H2O2作用PC12细胞24 h后，可见细胞损伤明显，细胞变圆，细胞间连接稀疏，少部分细胞脱落。给予不同剂量的GN后，细胞损伤减轻，与模型组相比，贴壁细胞数目增多，随着GN剂量的增加，细胞间连接越紧密，可见具有抗损伤作用。见图1。

图1 GN对H2O2致PC12损伤形态的影响(×200)

2.3 GN对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的作用 镜下可见，细胞经吖啶橙染色后，正常组细胞形态规则，绿色均匀，细胞间连接紧密；模型组可见细胞变圆，部分细胞核染色质浓染，碎裂，脱落；给予GN不同剂量干预后，出现核浓染的细胞少，细胞形态大部分正常，细胞损伤程度比模型组明显减轻。见图2。

图2 GN对H2O2诱导PC12凋亡的影响(吖啶橙荧光染色，×200)

2.4 GN对H2O2诱导PC12细胞ROS升高的影响 正常组平均荧光强度值为(0.85±0.20)，模型组平均荧光强度值为(5.05±0.47)，与正常组比较，具有显著差异(P<0.01)，显示细胞内ROS水平升高显著；给予低、中、高剂量的GN处理后，其平均荧光强度值则分别为(4.06±0.18)、(3.18±0.20)和(2.13±0.25)，与模型组比较，均明显降低(P<0.05或P<0.01)。而10 μmol/L的GB组ROS荧光强度值为(2.09±0.16)，表明GN可拮抗H2O2刺激的PC12损伤时ROS水平的升高。

2.5 GN对H2O2刺激PC12细胞Bcl- 2、Bax mRNA表达的影响 H2O2诱导PC12细胞Bcl- 2 mRNA表达降低(P<0.01)，Bax mRNA表达升高(P<0.01)，给予不同剂量的GN后，可逆转上述基因的表达。可见，GN可拮抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡。见表1。

2.6 GN对H2O2刺激PCl2细胞Bcl- 2、Bax蛋白表达的影响 H2O2作用PC12细胞24 h后，细胞Bcl- 2表达下降(P<0.01)，而Bax蛋白表达增加(P<0.01)。给予不同剂量的GN干预后，可逆转上述蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。这表明GN可抑制H2O2诱导的PC12细胞的凋亡。见图3，表2。

表1 GN对H2O2刺激PC12细胞Bcl- 2、Bax mRNA表达的影响

与模型组比较：1)P<0.05,2)P<0.01，下表同

1～6：正常组、模型组、低剂量GN组、中剂量GN组、高剂量GN组、GB组图3 GN对H2O2刺激PC12细胞Bcl- 2和Bax蛋白表达的影响

组别Bcl-2/β-actinBax/β-actin正常组1.289±0.0642)1.037±0.0652)模型组0.808±0.0771.319±0.091低剂量GN组1.139±0.0942)1.143±0.0361)中剂量GN组1.065±0.0582)1.066±0.0612)高剂量GN组1.114±0.0982)1.078±0.0842)GB组0.96±0.0601)1.012±0.0792)

3 讨 论

PC12 细胞来源于肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，具有神经细胞的一般特征，可传代，有利于量化评估药效，因此常用作神经生理和神经药理学研究，是比较理想的细胞模型〔8〕。H2O2作为机体自由基产生的重要环节，在细胞培养体系中，可进一步分解为羟自由基和氧自由基，而自由基可直接攻击细胞膜结构，导致细胞能量代谢出现障碍、损伤膜的离子依赖性 ATP 酶及谷氨酸载体，导致细胞凋亡〔9〕。研究证实，ROS包括超氧离子、羟自由基等，是细胞内氧化应激的重要因素之一。ROS 可通过氧化损伤，导致DNA、膜脂和蛋白质等多种生物分子损伤，细胞功能障碍，甚至诱导细胞凋亡或坏死〔10，11〕。H2O2参与了神经退行性疾病的发病过程，能使细胞内活性氧成分堆积，引起神经细胞凋亡。检测 ROS 的生成水平，可直接反映细胞内氧化应激的水平〔12〕。细胞凋亡过程中，Bcl 家族是体内重要的凋亡调控基因，包括抗凋亡基因和促凋亡基因两大类。其中抗凋亡基因Bcl- 2是目前最受关注的凋亡相关基因之一，通过编码 Bcl- 2 蛋白而发挥抗凋亡作用。促凋亡基因如 Bax，通过与 Bcl- 2 形成异源二聚体来阻断 Bcl- 2 的抗凋亡作用，从而启动细胞凋亡程序。此外，Bcl- 2 还具有神经保护功能，可以保护神经细胞免受氧自由基以及脂质过氧化产物的损伤〔13，14〕。

本实验显示不同剂量的GN能抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤和凋亡，从基因、蛋白水平上调Bcl- 2，下调 Bax表达水平，从而增高Bcl- 2/Bax两蛋白之间的比值，抑制细胞凋亡，可能是GN 对抗因H2O2诱导的PC12细胞损伤的机制之一。

1 Shi C,Liu J,Wu FM.Ginkgo biloba extract in Alzheimer′s disease:from action mechanisms to medical practice〔J〕.Int J Mol Sci,2010;11:107- 23.

2 Wang N,Chen XM,Geng DQ,etal.Ginkgo biloba leaf extract improves the cognitive abilities of rats with D- galactose induced dementia〔J〕.J Biomed Res,2013;27(1):29- 36.

3 Li JJ,Li JS,Hui RC.Ginkgo biloba extract for dementia:a systematic review〔J〕.Shanghai Arch Psychiatry,2013;25(1):10- 21.

4 刘秀萍，臧恒昌，于洪利.银杏叶提取物的研究进展与应用前景〔J〕.药学研究，2014;33(12)：721- 3.

5 Zhang X,Li Y,Zhang L,etal.A new ginkgolide from Ginkgo biloba〔J〕.J China Pharma Univ,2009;40(4):306- 9.

6 马舒伟，王丽艳，张文治，等.银杏内酯N对PC12细胞缺血性损伤的保护作用〔J〕.中华中医药杂志，2012;27(9)：2409- 12.

7 赵珍东，张雷红，夏 黎，等.银杏叶内酯N对谷氨酸诱导的PC12损伤的保护作用〔J〕.中药材，2015;30(8)：144- 9.

8 Malekinejad H，Moradi M，Fink- Gremmels J.Cytochrome C and Caspase- 3/7 are involved in mycophenolic acid- induced apoptosis in genetically engineered PC12 neuronal cells expressing the p53 gene〔J〕.Iran J Pharm Res,2014;13(1):191- 8.

9 Piao YF,Shi Y,Gao PJ.Inhibitory effect of all- trans retinoic acid on human hepatocellular carcinoma cell proliferation〔J〕.World J Gastroent erol,2003;9(9):2117- 20.

10 Buonocore G，Perrone S，Tataranno ML.Oxygen toxicity:chemistry and biology of reactive oxygen species〔J〕.Semin Fetal Neonatal Med,2010;15(4):186- 90.

11 Circu ML,Aw TY.Reactive oxygen species，cellular redox systems and apoptosis〔J〕.Free Radic Biol Med,2010;48(6):749- 62.

12 Chang QZ,Zhang SL,Yin JB.Role of chloride channels in nitric oxide- induced rat hippocampal neuronal apoptosis in vitro〔J〕.Neural Regen Res,2010;5(9):690- 4.

13 王晓敏，席晓甜，刘海云，等.菟丝子总黄酮对血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(10)：5742- 4.

14 肖兴花.粒细胞集落刺激因子对实验性脑出血大鼠血肿周围组织中Bax及Bcl- 2蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(6)：2927- 9.

〔2016- 06- 19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

广东省中医药局项目(No.20121106)；广东食品药品职业学院院级项目(No.2011YZ001)

汪小根(1970- )，男，博士，教授，主要从事中药制剂及药物作用机制研究。

赵珍东(1976- )，男，博士，副教授，主要从事中药抗神经损伤、抗肿瘤作用及机制研究。

R285

A

1005- 9202(2017)15- 3656- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.007

1 广东省中药研究所