周 鹏

(济源市人民医院肝胆外科，河南 济源 454650)

肝硬化患者血清miR- 122的表达及与Child- Pugh分级的关系

周 鹏

(济源市人民医院肝胆外科，河南 济源 454650)

目的 探讨肝硬化患者血清MicroRNA(miR)- 122的表达水平与肝硬化Child- Pugh分级及并发症的关系。方法 肝硬化患者87例，采用PCR实时荧光定量法测定患者血清miR- 122水平，根据Child- Pugh分级对肝硬化患者进行分级，分析血清miR- 122与肝硬化分级的关系。结果 并发肝硬化腹水、消化道出血、自发性细菌性腹膜炎及失代偿期患者血清miR- 122表达水平均高于未发生患者(P<0.05)；不同肝硬化 Child- Pugh分级血清中 miR- 122水平有统计学差异(P<0.05)，A级与B 级肝硬化患者血清miR- 122水平无显著差异(P>0.05)，A级和B级患者水平均显著低于C级(P<0.05)。多变量线性相关性显示，血清miR- 122与丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ- 谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)呈正相关(P<0.05)；与国际标准化比值(INR)及肌酐(Cr)水平呈负相关(P<0.05)。结论 血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已经失代偿，并与腹水、消化道出血、肝肾衰竭有关。因此，血清 miR- 122可作为评价肝硬化患者肝脏功能及预后的潜在生物学指标。

肝硬化；miR- 122；Child- Pugh分级

我国慢性肝炎病毒感染是导致原发性肝癌或肝硬化的主要病因。MicroRNA(miR)是内源性非编码单链RNA，能够选择性与mRNA结合，抑制mRNA翻译，并促进其降解，抑制靶基因表达〔1〕。研究发现〔2〕，miR在机体细胞分化、增殖、凋亡及组织器官发育等过程均具有重要的调控作用，其在多种疾病发生过程中均具有一定的作用。由于miRNA结构较小且相对稳定，因此被广泛应用于疾病分型、诊断、预后及个性化诊疗〔3〕。目前，miR与肝炎病毒感染后疾病进展的关系尚未完全明确，动物模型显示〔4〕，感染肝炎病毒后动物体内血清miR的水平会明显升高。有研究提出miRNA与肝炎病毒复制、肝硬化、慢性肝病及肝癌的发生、发展均具有密切关系〔5〕。本研究旨在探究肝硬化患者血清miR- 122的表达水平与肝硬化分级及并发症的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年6月至2016年3月济源市人民医院收治的87例肝硬化患者。纳入标准：①诊断标准结合患者病史、临床标准、肝活检及影像学进行综合诊断确诊〔6〕；②行病理学检查；③研究前1个月均未服用保肝类药物治疗。排除标准：①合并免疫系统疾病、恶性肿瘤等严重疾病者；②不配合及中途退出者。其中男66例，女21例；年龄41～74〔平均(56.32±6.93)〕岁。采用Child- Pugh对肝硬化患者进行分级〔7〕，Child- Pugh得分5～6分为A级，7～9分为B级，≥10分为C级；其中A级33例，B级31例，C级23例。

1.2 仪器和试剂 荧光定量ViiATM7、PCR仪与TC- 48/T/H PCR扩增仪均购于Applied Biosustems公司；美国Invitrogen公司提供患者总RNA提取的试剂盒。Taq Man Universal PC Rmastermix，反转录试剂盒Taq Manmi RNA，特异探针miR- 122均购于美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 肝肾功能指标检测 患者于首次入院后第1天在清晨空腹采集静脉血3 ml，2 h 内分离血清，由本院检验中心DXC- 800全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ- 谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、国际标准化比值(INR)及肌酐(Cr)水平、血清总蛋白(TP)及胆红素。

1.3.2 血清miRNA提取 87例患者首次入院后第2天采集3 ml清晨空腹静脉血，于20℃～25℃放置30 min左右，以4 000 r/min离心10 min，吸取上清于EP管保存分装，最后将分装后的EP管保存至-20℃的冰箱以备提取。按照MiRcute试剂提取试剂盒说明书提取血清miRNA。测定提取的RNA OD260/280的比值，比值介于1.8～2.0即可进行后续试验。

1.3.3 逆转录反应 (1)逆转录反应体系的配制：0.1 μl dNTPmix(100 mmol/L)，3 μl 5×反转录酶缓冲液，1.0 μl 50 U/μl MultiScribeTM反转录酶，1.8 μl MgCl2及4.1 μl无核酸酶的水。(2)将反应体系混合溶液短暂离心，分装9 μl/管，再依次加入5 μl RNA模板，3 μl primer，混匀、离心。miR- 122 PCR 正向引物序列为：5′- TGCGGATCAACAGACATTAATT- 3′。(3)设置反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于预先设定好条件的PCR扩增仪上进行扩增。(4)反应完成后将cDNA溶液置于-20℃低温冰箱中保存，以备用于实时荧光定量PCR。

1.3.4 PCR反应 采用TaqmanHT7900荧光定量PCR仪进行PCR扩增，反应条件为95℃ 10 min；94℃ 10 s，60℃ 1 min，45个循环，反应体系为10 μl反应体系(Master Mix 5 μl，正反向引物各 0.2 μl，cDNA 1 μl，水3.60 μl)，每个样品进行3个反应。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验及多变量线性相关性分析。

2 结 果

2.1 不同肝硬化并发症中血清miR- 122的表达水平 并发肝硬化腹水、消化道出血、自发性细菌性腹膜炎及失代偿期患者血清miR- 122表达水平(38.1±3.3，37.2±4.5，38.5±4.3，36.2±3.1)均高于未发生患者(25.3±4.3，26.2±3.7，27.4±3.5，25.1±4.3；t=10.041，8.972，9.191，8.183；P=0.001，0.002，0.002，0.003)。

2.2 不同肝硬化分级患者血清miR- 122及肝功能指标比较 不同肝硬化Child- Pugh分级血清中miR- 122水平有统计学差异(P<0.05)，两两比较发现A级与B 级肝硬化患者表达无统计学差异(t=1.217；P=0.199)，A级和B级显著低于C级(t=4.597，P=0.001；t=4.125，P=0.002)；不同肝硬化分级患者ALT、AST、GGT、ALP、INR及Cr水平差异均有统计学意义(P<0.05)，而血清TP及胆红素无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 不同肝硬化分级患者血清miR- 122及肝功能指标比较

与C级比较：1)P<0.05

2.3 血清miR- 122水平与肝肾功能指标的关系 血清miR- 122表达水平与ALT、AST、GGT、ALP 呈正相关(r=0.514、0.672、0.578、0.711、P<0.05)，与INR及Cr水平呈负相关(r=-0.612、-0.417，P<0.05)，而与TP及胆红素关系不明显。

3 讨 论

近年来，研究发现miR- 122主要表达于肝脏细胞，参与肝脏细胞的分化生长，对于肝脏发挥正常的生理功能具有重要作用，因此可以作为肝细胞损伤的一个重要潜在生物学指标〔8〕。Child- Pugh分级是评价肝脏分解合成功能的重要评分指标，其通过凝血酶原时间、胆红素、白蛋白以及肝性脑病和腹水等评价指标全面综合反映肝脏的整个病变程度，可以作为肝脏预后的综合评价指标。

本研究结果提示患者血清miR- 122表达上升可能与并发肝硬化腹水、消化道出血、自发性细菌性腹膜炎有关，或正处于失代偿期，其原因可能与患者发生腹水导致血清 miR- 122进入其他淋巴通道等第三间隙增多引起〔9〕。因此，对于肝硬化合并并发症患者的评价来讲，高表达的血清miR- 122表明预后恢复情况可能会越差。本研究结果提示血清中 miR- 122 的水平可作为肝硬化患者的预后评价指标，另外Child- Pugh分级对于肝脏功能评价具有重要意义。在肝硬化患者中，血清中 miR- 122水平与各种转氨酶的水平均呈正相关，这表明肝脏细胞的损伤及坏死伴随着血清中 miR- 122的水平增高，这可能由于坏死的肝细胞释放部分miR- 122，同时由于细胞坏死导致肝细胞不能正常降解miR- 122〔10〕。肝硬化患者中血清 miR- 122 水平和INR呈现负相关关系也说明了这一点。上述证据均显示血清miR- 122水平可反映肝功能的损伤程度。本研究中低水平的血清miR- 122提示存在更高水平的Cr，表明肾功能的损害以及肝细胞增生能力的降低，这可能由于肝衰竭同时合并肾衰竭导致整个循环紊乱〔11〕。同时研究发现肾衰竭时部分miR的表达降低。此外，在本研究中血清miR- 122与其他代表肾功能损害的胆红素以及血红蛋白等并不相关，这可能由于肝硬化病人的肠道营养、药物运用导致这些指标水平的相应变化导致。血清miR- 122 水平上升提示肝硬化已经失代偿，并与腹水、消化道出血、肝肾衰竭有关。因此，血清 miR- 122可作为评价肝硬化患者肝脏功能及预后的潜在生物学指标。

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〔2017- 02- 18修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

周 鹏(1982- )，男，主治医师，主要从事肝胆外科研究。

R657.3+1

A

1005- 9202(2017)15- 3802- 02；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.071